Characterisation of the protein-protein interaction between an alpha-arrestin and its regulatory kinase in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

[EN] The plasma membrane contains a wide spectrum of transporter proteins, each responsible for a facet of the cell’s nutritional and signalling requirements. Thus, the membrane is subject to extensive remodelling allowing the cell to rapidly respond to extracellular conditions. Membrane transporters selectively receive post-translational modifications, marking them as cargo; ubiquitylation being fundamental in this role. The ART (arrestin related trafficking adaptors) family of proteins mediate the interaction of Rsp5, a HECT ubiquitin ligase, with specific membrane proteins to bring about membrane remodelling in response to extracellular cues. TORC1 is a central regulator of growth has been implicated in membrane remodelling modification of the activity of Npr1, an effector kinase responsible for signal transduction to the ARTs. Art3, a member of the ART family, has been identified as a substrate of Npr1; however, its role in membrane remodelling mechanisms is yet unclear. This project centres on the exploration of the protein-protein interaction using a series of techniques including bimolecular fluorescence complementation, the yeast-two-hybrid assay and affinity purification using a glutathione S-transferase fusion protein. The effect of a range of TORC1 activity-modifying conditions on the interaction was also analysed.

[ES] La membrana plasmática contiene un amplio espectro de proteínas transportadoras, cada una responsable de una faceta de los requerimientos nutricionales y señalizadores de la célula. Por tanto, la membrana está sujeta a una remodelación extensiva permitiéndo a la célula responder de forma veloz a condiciones extracelulares. Los transportadores sufren modificaciones post-traduccionales de forma selectiva marcándoles como cargos; la ubiquitilación es fundamental en este papel. La familia ART (arrestin related trafficking adaptors) media la interacción con Rsp5, una ubiquitina-ligasa de la familia HECT, con proteínas de membrana específicas para promover la remodelación de la membrana en respuesta a estímulos extracelulares. TORC1 es un regulador central del crecimiento y está implicado en la remodelación de la membrana plasmática mediante la modulación de la actividad de Npr1, la quinasa responsable de la transducción de señales desde TORC1 a los ARTs. Art3, otro miembro de la familia ART, se ha mostrado como sustrato de Npr1. Sin embargo, su papel en los mecanismos de remodelación de la membrana no está claro todavía. Este trabajo se centra en la exploración de la interacción proteína-proteína utilizando una serie de técnicas, incluyendo doble híbrido y la purificación por afinidad de proteínas de fusión a glutatión-S-transferasa. El efecto de condiciones modificadoras de la actividad de TORC1 sobre la interacción también se estudió.