Formación de dímeros pirimidínicos en el estado excitado triplete: Ciclobutanos frente a fotoproductos (6,4)

Abstract

[EN] UV radiation is able to induce changes in the chemical composition of DNA that have been closely related to skin cancer. Among the most relevant lesions, damage to pyrimidine bases leading to bipyrimidine units (cyclobutane dimers and (6,4) photoproducts) are found. The overall thesis objective is to clarify some of the DNA photoreaction mechanisms. First of all, the influence of C5 substitution on the photophysical properties of 2-thiopyrimidines (2-thiouracil (TU), 5-tert-butyl-2-thiouracil (BTU) and 2-thiothymine (TT)) was determined. The UV spectra displayed showed a maximum around 275 nm and a shoulder at ca. 290 nm. The three 2-thiopyrimidines exhibited a strong phosphorescence emission ET of ca. 307, 304 and 294 kJ/mol for TU, BTU and TT, respectively. Transient absorption spectra displayed after excitation at 308 nm gave rise to a broad band ranging from 500 nm to 700 nm. The triplet lifetime were 70 ns, 1.1 microseconds and 2.3 microseconds, for TU, BTU and TT, respectively. Theoretical calculations at the B3LYP/aug-ccpVDZ/PCM level were also done. Results were agree well with the experimental range of excited state energies and support the pp* nature of the lowest triplet states.

Secondly, the influence of steric hindrance on the formation of bipyrimidine lesions was analyzed by introducing a bulky substituent at C5 position of uracil. Thus, the reactivity of 5-tert-butiluracil methyl ester (1c) was compared to its thymine analogue (2c) after BP, xanthone and acetone photosensitization. Benzophenone photoreaction led exclusively to oxetanes while acetone gave rise to uracil-5-tert-butiluracil heterodimers (1e-1 and 1e-2), an acetonyl derivative (1e-3) and to a dehydrogenation photoproduct (1e-4). In the case of xanthone only one oxetane (1f) was observed. However, parallel irradiations performed with 2c, revealed the formation of cyclobutane dimers in all cases. Then, the photochemistry of thymine from its upper np* triplet excited states, through the Norrish-Yang photocyclation was explored. This required design-ing a dyad that consisted of a 5-tert-butiluracil moiety covalently linked by an aliphatic amide to BP chromophore. Benzophenone was chosen as a photo-sensitizer. The multiphotonic excitation of the dyad was performed using a laser beam at high power (40 mJ/pulse) and then the reaction mixture was analyzed by UPLC-MS/MS. The results showed that the Norrish- Yang photo-cyclation was produced by the formation of expected pyrimidone compound. The chemical yield was 0.003%. The last chapter of this thesis addresses the possibility that the photoproduct (6,4) once formed in DNA, could act as an endogenous photosensitizer. This lesion is capable of absorbing light in the UVB-UVA region because of the presence in its structure of the 5-methyl-2-pyrimidone moiety (Pyo). It was irradiated in the presence of DNA to analyze the photoinduced damage in the biomacromolecule. The experiments established that Pyo acts as a photosensi-tizer in DNA. Indeed, photophysical studies conducted with Pyo confirmed that it can participate in energy transfer and oxidative processes Since the photochemical properties of the whole lesion may differ from the isolated chromophore Pyo, the 6,4 PP potential to act as a photosensitizer was also considered. Irradiation of 6,4 PP in the presence of DNA revealed that in fact, it can act as a photosensitizer too, although their photophysical properties are not entirely coincident. Thus, this chapter has served to establish that (6,4) photoproduct can act as a Trojan horse and extend the active fraction of UV radiation, causing the formation of pyrimidine dimers and oxidative damage, making it potentially more dangerous than estimated so far.

[ES] La radiación UV está asociada a la formación de lesiones en el ADN que son el origen del cáncer piel. Las más relevantes son los DCBs y 6,4 PPs. El objetivo general de esta tesis doctoral es esclarecer algunos de los mecanismos de la fotorreacción del ADN. En primer lugar se estableció la influencia de la sustitución en C5 sobre las propiedades fotofísicas de 2-tiopirimidinas (2-tiouracilo (TU), 2-tiotimina (TT) y 5-tert-butiluracilo (BTU)). Los espectros de UV presentaron un máximo sobre 275 nm y un hombro sobre 290 nm. Las tres 2-tiopirimidinas exhibieron una intensa de fosforescencia, de cuyos espectros se determinaron las ET: 307, 304 y 294 kJ/mol para TU, BTU y TT, respectivamente. Los espectros de absorción transitoria obtenidos presentaron una banda desde 500 nm a 700 nm, que se asignó a la absorción triplete-triplete. Los tiempos de vida de triplete fueron de 70 ns, 1.1 microsegundos y 2.3 microsegundos para TU, BTU y TT, respectivamente. Además se realizaron cálculos teóricos B3LYP/aug-cc-pVDC/PCM. Los resultados obtenidos concordaron con los experimentales, respaldando la naturaleza pp* de los estados triplete excitados más bajos. En segundo lugar, se analizó la influencia del impedimento estérico en posición C5 sobre la formación de lesiones bipirimidínicas. Para ello se comparó la reactividad del 5-tert-butiluracilacetato de metilo (1c) con la de su análogo de timina (2c) tras fotosensibilizar con benzofenona, acetona y xantona. La reacción con benzofenona (BP) dio lugar exclusivamente a oxetanos. En el caso de usar acetona como sensibilizador se obtuvieron dímeros mixtos uracilo-5-tert-butiluracilo (1e-1 y 1e-2), el derivado acetonilo (1e-3) y un fotoproducto fruto de la deshidrogenación (1e-4). En el caso de la xantona solo se observó la formación de un único oxetano (1f). Sin embargo, las irradiaciones paralelas llevadas a cabo con 2c, condujeron a la formación de dímeros ciclobutánicos en todos los casos. A continuación se exploró la fotoquímica de la timina desde su estado excitado superior triplete np* a través de la fotorreacción de Norrish-Yang. La estrategia a seguir consistió en poblar dicho estado por transferencia de energía desde un estado excitado triplete superior de un fotosensibilizador adecuado. Para ello se diseñó una diada (1a) formada por el compuesto 5-tert-butiluracilo enlazado mediante una amida alifática al cromóforo benzofenona (BP). Se llevó a cabo la excitación multifónica de 1a con un haz de láser a una potencia elevada (40 mJ/pulso) y la mezcla de reacción se analizó mediante UPLC-MS/MS. Los resultados evidenciaron la formación de la pirimidona esperada tras tener lugar la reacción de Norrish-Yang con un rendimiento químico de formación de fotoproducto del 0.003 %. El último capítulo de la tesis aborda la posibilidad de que el fotoproducto (6,4) una vez formado en el ADN, actúe a su vez como fotosensibilizador endógeno, debido a que esta lesión es capaz de absorber la luz en la región UVB-UVA debido a la presencia en su estructura de 5-metil-2-pirimidona (Pyo). Para ello se sintetizó Pyo y se irradió en presencia de ADN. El análisis de los daños foto-inducidos en la biomacromolécula permitió establecer que Pyo puede ser un fotosensibilizador del ADN. Además, los estudios fotofísicos llevados a cabo con Pyo confirmaron que puede participar tanto en procesos de TE como en procesos oxidativos Este capítulo ha servido para establecer que el propio daño 6,4 PP puede actuar como caballo de Troya y extender la fracción activa de la radiación UV, provocando la formación de dímeros pirimidínicos y daños oxidativos, convirtiéndolo en un daño potencialmente más peligroso de lo estimado hasta la fecha.

[CA] La radiació UV està associada amb la formació de lesions en l'ADN que son l'origen del càncer de pell. Les més rellevants DCBs i 6,4 PPs. L'objectiu general d'aquesta tesi doctoral va ser aclarir alguns dels mecanismes de la fotorreacció de l'ADN. Primer es va establir la influència de la substitució en C5 sobre les propietats fotofísiques de 2-tiopirimidines (2-tiouracil (TU), 2-tiotimina (TT) i 2-tert-butiluracil (BTU)). Els espectres UV registrats presentaren un màxim sobre 275 nm. Les tres 2-tiopirimidines exhibiren una intensa fosforescència, a partir dels espectres de la qual es van determinar les energies dels seus estats excitats triplets: 307, 304 y 294 kJ/mol per TU, BTU i TT, respectivament. Els espectres d'absorció transitòria obtinguts per excitació làser (308 nm) presentaren una banda des de 500 nm a 700 nm. Els temps de vida de triplet van ser 70 ns, 1.1 microsegons i 2.3 microsegons per a TU, BTU i TT, respectivament. A més, es van realitzar càlculs teòrics B3LYP/aug-cc-pVDC/PCM. Els resultats obtinguts van concordar amb els experimentals, recolzant la natura pp* dels estats triplet excitats més baixos. En segon lloc, es va analitzar la influència de l'impediment estèric en posició C5 sobre la formació de lesions bipirimidíniques. Així es va comparar la reactivitat del 5-tert-butiluracilacetat de metil (1c) amb el seu anàleg de timina (2c) al fotosensibilitzar amb benzofenona (BP), acetona i xantona. La reacció amb BP originà exclusivament oxetans. En el cas d'usar acetona com a fotosensibilització es van obtenir dímers mixtes uracil-5-tert-butiluracil (1e-1 i 1e-2), el derivat acetonil (1e-3) i un fotoproducte fruit d' una deshidrogenació (1e-4). En el cas de la xantona, sols es va observar a formació d'un únic oxetà (1f). No obstant, les irradiacions paral·leles dutes a terme amb 2c van conduir a la formació de dímers ciclobutànics en tots els casos. A continuació, es va explorar la fotoquímica de la timina des del seu estat excitat superior triplet np* a través de la fotorreacció de Norrish-Yang. L' estratègia a seguir va consistir a poblar el mencionat estat per transferència d'energia des d'un estat excitat triplet superior d'un fotosensibilitzador adequat. Per dur-ho a terme, es va dissenyar una diada formada pel compost 5-tert-butiluracil, susceptible de sofrir un procés de Norrish-Yang, enllaçat per una amida alifàtica al cromòfor BP. Així, es va dur a terme una excitació multifotònica de la diada amb un fluix de làser a una potencia elevada (40 mJ/pols) i posteriorment la barreja de reacció es va analitzar amb un UPLC-MS/MS. Els resultats evidenciaren la formació de la pirimidona esperada al tenir lloc la reacció de Norrish-Yang amb un rendiment químic de formació de fotoproucte del 0.003 %. En l'últim capítol de la tesi s'aborda la possibilitat de que el fotoproducte (6,4) una vegada format a l'ADN, actue a la vegada com a fotosensibilitzador endogen, ja que aquesta lesió té la capacitat d'absorbir en la regió UVB-UVA per la presència en la seua estructura de 5-metil-2-pirimidona (Pyo). Així, es va sintetitzar Pyo i es va irradiar en presència d'ADN. L'anàlisi de les lesions fotoin-duïdes en la biomacromolécula van permetre establir que Pyo pot ser un foto-sensibilitzador d' ADN. A més, els estudis fotofísics fets amb Pyo van confirmar que pot ser partícep tant en processos de transferència d'energia com en pro-cessos oxidatius. Aquest capitol ha servit per establir que el propi dany 6,4 PP pot actuar com a cavall de Troia i estendre la fracció activa de la radiació UV, provocant la for-mació de dímers pirimidínics i danys oxidatius, convertint-lo en un dany potencialment més perillós d'allò estimat fins la data.