Evaluación de la toxicidad de nanovesículas en células de retina

Abstract

[ES] El objetivo de este trabajo es evaluar la toxicidad in vitro e in vivo de un tipo de nanovesículas denominadas quatsomes, con la finalidad de poder utilizarlas como nanocarriers de drogas que retrasen la degeneración retiniana que ocurre en la patología denominada retinosis pigmentaria. Los quatsomes son unas estructuras vesiculares termodinámicamente estables, constituidas por surfactantes amónicos cuaternarios y esteroles. En este trabajo se evalúa la toxicidad de tres tipos de quatsomes que difieren en los surfactantes por los que están formados (CTAB: Cetyl trimethylammonium bromide; CPC: Cetylpyridinium chloride y MKC: Myristalkonium Chloride ), con el fin de conocer cuál de ellos es el que tiene menor toxicidad. En primer lugar se evalúa la toxicidad in vitro en una línea celular inmortal de fotorreceptores (conos) murinos, la línea 661W. Se realiza una curva de concentración para determinar la concentración de quatsomes óptima que no sea tóxica para las células. Una vez determinada dicha concentración se elegirán los quatsomes con el surfactante menos tóxico. Para llevar a cabo este objetivo se cultivan las células 661W en presencia de los distintos quatsomes durante 24 horas y 48 horas en un rango de concentraciones que varía en función de cada surfactante. A continuación, se realiza un ensayo de viabilidad celular denominado ensayo MTT (metil tiazol tetrazolio) que consiste en un ensayo colorimétrico basado en la reducción del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT). Este método permite medir supervivencia y proliferación celular, así como también, determinar la citotoxicidad de potenciales agentes terapéuticos. Una vez determinada la toxicidad in vitro de los quatsomes, se selecciona la nanovesícula menos tóxica y, se administra intravítreamente a una concentración óptima a ratones control para evaluar la toxicidad in vivo. Para ello se evalúan marcadores de muerte celular y de inflamación en retina de ratón. En primer lugar se realiza la técnica de TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick-end-labeling) para detectar la fragmentación de ADN en células apoptóticas principalmente y de este modo conocer si las nanovesículas están causando procesos de muerte celular programada en la retina de los ratones tratados. En segundo lugar, se realiza una inmunofluorescencia con el fin de evaluar la presencia de gliosis reactiva como marcadores de inflamación. En concreto, se emplean los anticuerpos contra GFAP (Glial fibrillary acidic protein) e IBA1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1) como marcadores de la glía de Müller y de microglía, respectivamente.

[EN] The aim of this study is to assess the in vitro and in vivo toxicity of a type of nanovesicle named quatsomes, in the pursuit of using them as drug nanocarriers to delay the retinal degeneration that happen in the pathology called retinitis pigmentosa. The quatsomes are thermodynamically stable nanovesicle structures, make by quaternary ammonium surfactants and sterols. In this study the toxicity of three types of quatsomes differing in surfactants for which they are made (CTAB: Cetyl trimethylammonium bromide; CPC: Cetylpyridinium chloride y MKC: Myristalkonium Chloride) is evaluated in order to know which of them is the less toxic. Firstly, the in vitro toxicity is assessed in an immortal murine photoreceptors cell line, the 661-W line. A concentration curve is made to establish optimum quatsome concentration non toxic to the cells. Secondly, the quatsomes made by the less toxic surfactant are chosen. To accomplish this goal the 661-W cells are cultured with the different quatsomes for 24 hours and 48 hours in a concentrations range that varies according to each surfactant. Then a cell viability assay called MTT assay (metil tiazol tetrazolio) is made, it is a colorimetric assay based on the Bromure de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) reduction. This method allows to measure cell survival and proliferation, as well as determine the potential therapeutic agents citotoxicity. After determining in vitro toxicity of quatsomes, the least toxic nanovesicle is selected and is administered intravitreally at an optimal concentration to control mice to assess the in vivo toxicity. For this, cell death and inflammation markers of mice retina are evaluated. Firstly, TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling) is performed to detect DNA fragmentation in apoptotic cells and thus know whether the nanovesicles are causing process of programmed cell death in the mice retina treated. Secondly, immunofluorescence is performed in order to evaluate the presence of reactive gliosis as inflammation markers. Specifically, antibodies against GFAP (Glial fibrillary acidic protein) and IBA1 (Ionized calcium binding adapter molecule 1) as markers of Muller glia and microglia, respectively are used.