Caracterización molecular de modelos celulares asociados a tres genotipos de la Disqueratosis Congénita

Abstract

[ES] La Disqueratosis congénita (DC, ORPHA1775) está catalogada como una enfermedad rara, con una prevalencia 1 en 1.000.000. Se trata de una enfermedad progeroide que presenta una clásica triada de signos mococutaneos: hiperpigmentación, distrofia ungueal y leucoplasia de la mucosa oral. El origen génico es muy heterogéneo, debido a las diferentes mutaciones que afectan a los genes que codifican para las distintas subunidades del complejo Telomerasa y Telosoma. Estos complejos actúan en conjunto, regulando, manteniendo y reparando los telómeros. La DC presenta tres de herencia: autosómica dominante (TERT, TERC, TINF2), autosómica recesiva (NOP10, NHP2, TCAB1) y ligada al cromosoma X (DKC1). En esta investigación se utilizó la tecnología del ARN de interferencia, para generar los diferentes modelos celulares para cada uno de los genes seleccionados (DKC1, NOP10 y TINF2), que corresponden a cada uno de los subtipos de herencia de la DC. Una vez generados los modelos celulares, se procedió al análisis de la expresión génica global de estas lineas celulares mediante matrices de expresión (Affymetrix). Los resultados se obtuvieron por análisis bioinformatico mediante el software R con 'bioconductor'. Los paquetes que se utilizarón para el análisis de los genes diferencialmente expresados fueron 'Limma' y 'samr', para el análisis de las principales rutas alteradas se utilizó el test de Fisher con la base de datos de rutas metabólicas 'Gene Ontology' (GO). El objetivo de este trabajo es la validación de los resultados obtenidos en los modelos celulares generados de DC. Para ello, se establecen los siguientes puntos: - Determinación de modificaciones oxidativas en proteínas mediante Western Blot y Espectrometría de Masas. - Análisis de los niveles de expresión de las principales enzimas antioxidantes mediante qRT-PCR (i.e. SOD1, SOD2, CAT, GPX1, etc.) - Estudio de las marcas de daño al ADN mediante citometría de flujo (i.e gamma-H2AX y parsylación de histonas) - Estudio de los procesos de pseudouridinilación del ARN.

[EN] Dyskeratosis congenita (DC, ORPHA1775) is a rare disease, with a prevalence of 1 in 1.000.000 inhabitants. DC is a progeroid disease that presents a clasic triad of mucocutaneous signs: hyperpigmentation, nail dystrophy, and oral leukoplakia. DC is genetically heterogeneuos, consisting in different mutations which affect genes encoding for different subunits of Telomerase and Shelterin complex. These complexes work together, regulating, maintaining, and reparing the telomeres. The DC presents three types of inheritance: autosomal dominant (TERT, TERC, TINF2), autosomal recessive (NOP10, NHP2, TCAB1), and X-linked (DKC1). In this project, the student will work with three different cell models generated by RNA silencing technology. DKC1, NOP10 and TINF2 genes will be silenced to inhibit the expression of genes involved in each type of inheritance. The work of the student will be focused in the validation of previous results obtained by the group in which we observed using expression arrays (Affymetrix) different expression profiles for each cell line. The results were analyzed using bioinformatic analysis with the R software and ¿bioconductor¿. The packages we used for the analysis of the differentially expressed genes were ¿Limma¿ and ¿samr¿. The analysis of main altered metabolic pathways was conducted by means the Fisher¿s test with the data base of metabolic pathways ¿Gene Ontology¿ (GO). The aim of this work is to validate some of the results obtained by expression arrays in DKC, NOP10 and TINF2 cell models. Therefore, we propose the following objectives: - To determinate oxidative modifications in proteins by Western blot and MS - To analyze the expression levels of the main antioxidants enzymes by qRT-PCR (i.e. SOD1, SOD2, CAT, GPX1, etc.) - To study the DNA damage marks by flow cytometry (i.e gamma-H2AX and parsylation of histones) - To study pseudourinilation processes in RNA