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Resumen:
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[ES] La presencia de mutaciones somáticas en ciertos genes se asocia a la resistencia a los
tratamientos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de crecimiento epidérmico
(EGFR), implicado en el desarrollo ...[+]
[ES] La presencia de mutaciones somáticas en ciertos genes se asocia a la resistencia a los
tratamientos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de crecimiento epidérmico
(EGFR), implicado en el desarrollo del cáncer del colorrectal. Un ejemplo de son las mutaciones
el gen BRAF, cuyo papel en el cáncer se asocia principalmente con la peor supervivencia de los
pacientes afectados. Es por ello que el análisis mutacional de dicho gen es crítico, no sólo para la
selección de pacientes candidatos a recibir terapias basadas en inhibidores de EGFR, sino también
para pronosticar la enfermedad. A pesar de la amplia oferta de tecnologías disponibles, no se trata
de un campo científico-técnico completado, ya que no todos los sistemas sanitarios poseen la
capacidad para incorporar muchas de las técnicas existentes, debido principalmente al coste y al
tiempo requerido para el análisis.
El objetivo de este proyecto es contribuir en el desarrollo de un sistema de análisis mutacional
del gen BRAF basado en una tecnología de biosensado alternativa, que presente altas prestaciones
de trabajo y de fácil implantación en los laboratorios clínicos. Se seleccionó la mutación
c.1799T>A (V600E), ya que es la más frecuente en cáncer colorrectal metastásico y otros tipos de
cáncer. Para el enriquecimiento del alelo mutado respecto al nativo, se estudió el empleo de
agentes bloqueantes durante la reacción de amplificación. Para la detección de los productos
formados, se estudiaron dos métodos post-amplificación: detección mediante fluorescencia y
detección colorimétrica basada en hibridación con sondas específicas inmovilizadas en un biochip
de policarbonato. El método propuesto permitió disminuir selectivamente la amplificación de los
alelos nativos en un rango aproximadamente del 15-22 % y la discriminación de las
subpoblaciones en función del perfil de hibridación con elevada reproducibilidad (desviación
estándar < 20 %). La metodología se aplicó al análisis mutacional de muestras de tejidos
biopsiados embebidos en parafina y fijados en formalina de pacientes con cáncer colorrectal
metastásico. Se logró la detección de la mutación en los mismos casos reportados mediante una
técnica basada en secuenciación de siguiente generación (NGS, siglas en inglés). Los resultados
obtenidos muestran el potencial del método y su capacidad para apoyar el desarrollo de
tecnologías alternativas, permitiendo el seguimiento y asesoramiento médico personalizado.
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[EN] The presence of somatic mutations in certain oncogenes is associated with resistance to
treatments with monoclonal antibodies against epidermal growth factor (EGFR), involved in the
development of colorectal cancer. ...[+]
[EN] The presence of somatic mutations in certain oncogenes is associated with resistance to
treatments with monoclonal antibodies against epidermal growth factor (EGFR), involved in the
development of colorectal cancer. An example of this phenomenon, are mutations present in
BRAF oncogene, which role in cancer is mainly associated with the lower survival of affected
patients. For this reason, it is critical to perform a mutational analysis of this gene, not only for
selection of patients that will benefit from therapies based on inhibition of EGFR, but for
establishing the prognosis of the disease. Nevertheless, despite there is a wide offer of available
technologies, the scientific-technical field is not completed, so, not all of the sanitary systems
have the capacity to incorporate lots of the current techniques, mainly due to the cost and time
required for the analysis.
The goal of this project is to contribute in the development of a mutational analysis system
based on an alternative biosensing technology that offers optimal properties in its performance as
its easy implementation in clinical laboratories. It was selected mutation c.1799 T > A (V600E),
as it is the most frequent in metastatic colorectal cancer and in other types of cancer. In order to
enrich the mutant fraction respect to the wild type, it was studied the use of blocking agents
during the amplification reaction (PCR Clamp). For the detection of generated products, there
were studied two post-amplification methods: fluorescence detection and colorimetric detection
based on a hybridization assay with specific probes in a polycarbonate biochip. The proposed
method allowed the selective decrease of amplification of wild type alleles in a range of
approximately 15-22 %, as the discrimination of subpopulations due to their hybridization profile
with high reproducibility (standard deviation < 20 %). The methodology was applied in
mutational analysis of samples from formalin fixed and paraffin embedded biopsy tissues of
metastatic colorectal cancer patients. Mutation detection was achieved for the same reported cases
by a technique based on next generation sequencing. Obtained results show the potential of the
method and will serve to support the development of alternative technologies for monitoring and
personalized medical advice for each patient.
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