Perfiles de expresión de miRNAs y su asociación con firmas moleculares en la Leucemia Mieloide Aguda

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) is a hematologic malignancy characterized by the accumulation of hematopoietic mature myeloid cells in bone marrow and peripheral blood. Leukemic stem cells acquire a broad spectrum of cooperating genetic (chromosomic and molecular) and epigenetic lesions, which leads to proliferation, apoptosis and differentiation deregulation and transformation of hematopoietic stem cells 1,2 Cytogenetic analyses allow patient stratification in different risk groups that can be treated accordingly. Normal karyotype AML (NK-AML) represents 50% of patients and it is included within the intermediate risk group, Howerver, his group shows a very heterogeneous clinical outcome. Therefore, identification of molecular alterations is especially relevant in this group in order to apply the most appropriate therapeutic strategy. The Cancer Genome Atlas (TCGA) described the most recurrently mutated genes in AML and recently, they have proposed 9 functional categories in which genes are grouped according to their biological function. This functional classification suggests new cooperations in the development of the leukemic phenotype (transcription-factor fusions, gene encoding nucleophosmin, tumor-suppressor genes, DNA-methylation-related genes, signaling genes, chromatin-modifying genes, myeloid transcription-factor genes, cohesin-complex genes, and spliceosome-complex genes)3. Besides genetic factors, recent studies demonstrated that epigenetic alterations such as aberrant DNA promoter methylation and aberrantly expressed microRNAs (miRNAs) play an important role in the pathogenesis of AML5. miRNAs are small non-coding RNA molecules which hybridize to the 3¿-untranslated regions (3¿ UTR) of messenger RNAs (mRNAs) and cause their post-transcripcional regulation. Therefore, when miRNA expression is modified, they are able to act as tumor suppressors or oncogenes, altering gene expression and consequently signaling pathways. In this sense, miRNA control processes such as cell development, differentiation, proliferation and apoptosis6. miRNA expression profile in healthy hematopoietic progenitors change along differentiation and, it is able to correctly classify different molecular subtypes. Therefore, miRNA expression could be involved in the development of hematopoietic stem cells7,8 Recently, it has been described that miRNA expression profile allows distinguishing between AML and ALL and defining lineage-specific leukemia8. In addition, several studies have described correlations of miRNA expression with cytogenetics molecular markers in AML9. However, miRNA signatures within functional categories or other alternative genomic categories it has not been studied. The aim of this work is to determine which miRNAs are unregulated in AML, and study the mutational status of the most recurrent genes in a cohort of LMA-CN by Next Generation Sequencing. In this way, we will be able to determine which of them are as profiles with molecular markers in AML. In addition to determining the association of expression profiles with specific molecular alterations, we will explore associations with the functional categories proposed by the TCGA and with other classifications based on molecular markers4. For this purpose, we will determine, using miRNA expression arrays, which ones are deregulated in the AML compared to healthy hematopoietic progenitors (CD34+). Subsequently a selection of the most deregulated miRNAs will be validated by real-time PCR (qRT-PCR) in an independent group. In parallel, in a group of NK-AML patients, we will analyze the presence of somatic mutations by next generation sequencing using a panel of 19 genes, and we will determine the expression profiles of miRNAs in these patients. Statistical analysis will then be performed to determine its association with the mutational status of a gene or category. Determination of miRNA expression profiles associated with mutated categories in AML may aid in th

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una neoplasia hematológica caracterizada por la acumulación de células hematopoyéticas mieloides inmaduras en la médula ósea y en sangre periférica. Estas células adquieren un amplio espectro de alteraciones genéticas (cromosómicas y moleculares) y epigenéticas que alteran la proliferación, apoptosis y los procesos de diferenciación1,2 y contribuyen a la transformación maligna. Las alteraciones citogenéticas permiten la estratificación de los pacientes en distintos grupos de riesgo, sin embargo, aproximadamente un 50% de las LMAs no muestran ninguna alteración citogenética, presentando un cariotipo normal (LMA-CN). Este grupo de pacientes se cataloga de riesgo intermedio, si bien su desarrollo evolutivo es muy heterogéneo. Por ello, la identificación de alteraciones moleculares en este grupo es especialmente relevante a la hora refinar la clasificación del riesgo y por tanto poder aplicar la estrategia terapéutica más adecuada para cada paciente. El Cancer Genome Atlas (TCGA) describió los genes más frecuentemente mutados en la LMA y los ha agrupado, en base a su función, en 9 categorías funcionales, destacando así nuevas cooperaciones en el desarrollo del fenotipo leucémico (metilación del DNA, modificadores de la cromatina, factores de transcripción mieloides, supresores de tumores, nucleofosmina, cohesina, señales de activación, espliceosoma y fusiones de factores de transcripción)3. Además recientes estudios han demostrado que las alteraciones epigenéticas como la metilación aberrante de los promotores o la expresión aberrante de microRNAs (miRNAs) tienen un papel relevante en la leucemogénesis5

Los miRNAs, moléculas de RNA no codificante, se unen a las regiones no traducidas en el extremo 3¿ (3¿-UTR) de los RNA mensajeros (mRNA) provocando su regulación postranscripcional. De este modo, cuando la expresión de los miRNAs se ve alterada, pueden actuar como supresores tumorales u oncogenes, alterando la expresión génica y consecuentemente las vías de señalización. En este sentido, los miRNAs, participan en la regulación de la expresión génica, controlando procesos como el desarrollo, diferenciación y apoptosis6. El perfil de expresión de miRNAs en progenitores hematopoyéticos cambia a lo largo del proceso de diferenciación y permite clasificar correctamente los diferentes subtipos celulares. De este modo, se propone que la expresión de miRNAs puede estar involucrada en la diferenciación/maduración de las células madre hematopoyéticas7,8. Recientemente, se ha descrito que los perfiles de expresión de miRNA permiten distinguir entre LMA y otros tipos de leucemia9. Además, varios estudios han demostrado la asociación de perfiles de expresión de miRNA específicos con determinadas características citogenéticas y marcadores moleculares en la LMA10. Sin embargo, los perfiles de expresión de miRNA asociados a las categorías funcionales o categorías genómicas, no han sido estudiados. El objetivo de este trabajo es determinar qué miRNAs están desregulados en la LMA y estudiar en una serie de LMA-CN el perfil mutacional de los genes más recurrentemente mutados en la LMA por secuenciación masiva. Se buscarán asociaciones entre el perfil de expresión de miRNAs con marcadores moleculares y asociaciones de miRNAs con las categorías funcionales propuestas por el TCGA y con otras clasificaciones genómicas alternativas4. Para ello se determinará, mediante arrays de expresión, qué miRNAs aparecen desregulados en la LMA con respecto a progenitores hematopoyéticos sanos (CD34+). Posteriormente se hará una selección de los miRNAs más desregulados y se validarán por PCR a tiempo real (qRT-PCR) en una serie independiente de pacientes LMA-CN. Paralelamente, en estos pacientes, se analizará la presencia de mutaciones somáticas por secuenciación masiva empleando un panel de 19 genes. Finalmente se procederá a