Gómez Peris, AnaZapater Cardona, CintaMascoli, Alessia2026-04-292026-04-292026-03-272027-03-27https://riunet.upv.es/handle/10251/234605[ES] El control reproductivo es esencial para la domesticación de las especies acuícolas, ya que una regulación precisa de la gametogénesis permite obtener gametos y larvas de alta calidad y evitar fenómenos no deseados como la maduración precoz. Comprender los mecanismos endocrinos y paracrinos que regulan el desarrollo gonadal aporta conocimientos fundamentales y permite el desarrollo de herramientas para el control reproductivo en cautividad. En este contexto, la superfamilia TGF-ß constituye un eje central de la regulación reproductiva en vertebrados. Entre sus miembros, la hormona anti-mülleriana (Amh) y el factor derivado de células somáticas gonadales (Gsdf) desempeñan papeles clave en la diferenciación sexual y el desarrollo gonadal en teleósteos, aunque sus funciones, receptores y vías de señalización son poco conocidos. Esta tesis incluye la caracterización molecular, celular y funcional de Amh y Gsdf en la lubina europea (Dicentrarchus labrax), un modelo relevante para la acuicultura mediterránea. Para ello se ha aplicado un enfoque multidisciplinar integrando estudios de expresión génica y localización proteica, ensayos funcionales in vitro e in vivo, análisis evolutivos y experimentos de transactivación. Los objetivos principales incluyeron: caracterizar la expresión de amh, amhr2 y los parálogos gsdf1 y gsdf2 durante el desarrollo gonadal; esclarecer la función de Amh en gametogénesis y esteroidogénesis; reconstruir la evolución de gsdf y de los receptores TGF-ß; analizar la regulación transcripcional de gsdf; y determinar las interacciones funcionales ligando-receptor. Durante la diferenciación gonadal temprana, amh muestra una expresión gonadal 50 veces mayor en machos que en hembras. La proteína se localizó en testículos y ovarios adultos, confirmando su papel en ambos sexos, incluyendo la abundante presencia de Amh madura en ovarios post-vitelogénicos como forma bioactiva potencialmente circulante. Los ensayos funcionales revelaron un papel esteroidogénico no descrito previamente en teleósteos: la Amh potenció la acción de la Fsh en ovarios pre-vitelogénicos; y estimuló, in vitro e in vivo, la síntesis de andrógenos en testículos premeióticos. Además, la Amh de lubina estimuló la esteroidogénesis en testículos de medaka, mostrando conservación funcional entre especies. Ensayos realizados en sistemas heterólogos han mostrado que la Amh señaliza a través de Amhr2 activando tanto la vía canónica Smad1/5/8 (vía Alk2/3) como una vía no canónica, cAMP/PKA. La inhibición farmacológica evidenció interacciones entre ambas rutas, proporcionando una base mecanística para sus efectos esteroidogénicos. Se han identificado dos parálogos codificantes de Gsdf en lubina (gsdf1 y gsdf2), resultado de una duplicación independiente de la duplicación del genoma de los teleósteos. Sus patrones de expresión muestran dimorfismo sexual: gsdf1 predomina en testículos durante las fases iniciales de desarrollo, mientras que gsdf2 se expresa mayoritariamente en células foliculares ováricas. La regulación hormonal por Fsh, E2 y Amh, junto con la presencia de motivos reguladores en sus promotores, evidenció su integración en el control endocrino temprano de la gametogénesis. Finalmente, la caracterización funcional de los receptores TGF-ß de lubina reveló una notable plasticidad en la formación de dímeros de receptores tipo I/II y en la activación de vías Smad1/5/8 o Smad2/3, subrayando la versatilidad de este sistema en la regulación gonadal.[EN] Reproductive control is essential for the domestication of aquaculture species, as the precise regulation of gametogenesis enables the production of high-quality gametes and larvae while preventing undesired phenomena such as precocious maturation. Understanding the endocrine and paracrine mechanisms governing gonadal development provides fundamental knowledge and practical tools for reproductive management in captivity. In this context, the TGF-ß superfamily represents a central axis of reproductive regulation in vertebrates. Among its members, anti-Müllerian hormone (Amh) and gonadal soma-derived factor (Gsdf) play key roles in sexual differentiation and gonadal development in teleosts, although their functions, receptors, and signalling pathways remain only partially understood. This doctoral thesis investigates the molecular, cellular, and functional roles of Amh and Gsdf in the European sea bass (Dicentrarchus labrax), a species of major relevance for Mediterranean aquaculture. A multidisciplinary approach was applied, integrating expression and localization studies, functional assays in vitro and in vivo, evolutionary analyses, and transactivation experiments. The main objectives included characterizing the expression of amh, amhr2 and the gsdf paralogs during gonadal development; clarifying the role of Amh in gametogenesis and steroidogenesis; reconstructing the evolutionary history of gsdf and TGF-ß receptors; analysing the transcriptional regulation of gsdf; and determining functional ligand-receptor interactions. Amh showed a strongly male-biased expression during early gonadal differentiation, with levels approximately 50-fold higher in males than in females. Localization analyses confirmed its involvement in both testicular and ovarian development, including the presence of mature Amh in post-vitellogenic ovaries, suggesting a potentially circulating bioactive form. Functional assays revealed a previously undescribed steroidogenic role in teleosts: Amh enhanced Fsh-induced aromatase expression and E2 production in previtellogenic ovaries and stimulated androgen synthesis in premeiotic testes even in the absence of Fsh responsiveness. In vivo plasmid injections increased circulating 11-KT levels. Furthermore, sea bass Amh stimulated androgen production in medaka, indicating conserved bioactivity across teleost species. Heterologous systems demonstrated that Amh signals through Amhr2 via activation of the canonical Smad1/5/8 pathway (via Alk2/3) and also through a non-canonical cAMP/PKA pathway. Pharmacological inhibition uncovered interactions between both routes, providing a mechanistic basis for the observed steroidogenic effects. The study of Gsdf identified two species-specific paralogs (gsdf1 and gsdf2), originating from a duplication event independent of the teleost-specific whole-genome duplication. Their expression patterns were sexually dimorphic: gsdf1 predominated in males during early testicular development, whereas gsdf2 was mainly expressed in follicular cells of females. Hormonal regulation by Fsh, E2 and Amh, together with regulatory motifs in promoter regions, supported the integration of Gsdf into early endocrine control of gametogenesis. Finally, the functional characterization of TGF-ß receptors in sea bass revealed notable plasticity in type I/II receptor pairing and in the activation of Smad1/5/8 or Smad2/3 pathways, highlighting the versatility of this signalling network in gonadal regulation. Overall, this thesis redefines the role of Amh in teleosts as a positive regulator of steroidogenesis and demonstrates dual Smad/PKA signalling. It also reveals the functional diversification of gsdf paralogs and extensive flexibility in TGF-ß receptor usage. These findings provide a comprehensive molecular framework with potential applications for reproductive biotechnologies in aquaculture.[CA] El control reproductiu és essencial per a la domesticació de les espècies aquàtiques, ja que una regulació precisa de la gametogènesi permet obtenir gàmets i larves d'alta qualitat i evitar fenòmens indesitjats com la maduració precoç. Comprendre els mecanismes endocrins i paracrins que regulen el desenvolupament gonadal aporta coneixements fonamentals i permet el desenvolupament d'eines per al control reproductiu en captivitat. En aquest context, la superfamília TGF-ß constitueix un eix central de la regulació reproductiva en vertebrats. Entre els seus membres, l'hormona anti-mülleriana (Amh) i el factor derivat de cèl·lules somàtiques gonadals (Gsdf) exerceixen papers clau en la diferenciació sexual i el desenvolupament gonadal en teleòstes, encara que les seves funcions, receptors i vies de senyalització són poc conegudes. Aquesta tesi inclou la caracterització molecular, cel·lular i funcional de l'Amh i del Gsdf en llobarro (Dicentrarchus labrax), un model rellevant per a l'aqüicultura mediterrània. Per fer-ho, s'ha aplicat un enfocament multidisciplinari integrant estudis d'expressió gènica i localització proteica, assajos funcionals in vitro i in vivo, anàlisis evolutius i experiments de transactivació. Els objectius principals inclouen: caracteritzar l'expressió de amh, amhr2 i els paràlegs gsdf1 i gsdf2 durant el desenvolupament gonadal; aclarir la funció de l'Amh en gametogènesi i esteroidogènesi; reconstruir l'evolució del gsdf i dels receptors TGF-ß; analitzar la regulació transcripcional del gsdf; i determinar les interaccions funcionals lligand/receptor. Durant la diferenciació gonadal primerenca, l'amh mostra una expressió gonadal 50 vegades major en mascles que en femelles. La proteïna es localitza en testicles i ovaris adults, confirmant el seu paper en ambdós sexes, incloent-hi la presència abundant d'Amh madura en ovaris post-vitel·logènics com a forma bioactiva potencialment circulant. Els assajos funcionals han revelat un paper esteroidogènic no descrit prèviament en teleòstes: l'Amh potencia l'acció de la Fsh en ovaris pre-vitel·logènics i estimula, in vitro i in vivo, la síntesi d'andrògens en testicles premeiòtics. A més, l'Amh de llobarro estimula l'esteroidogènesi en testicles de medaka, mostrant conservació funcional entre espècies. Assajos realitzats en sistemes heteròlegs han mostrat que l'Amh senyalitza a través d'Amhr2 activant tant la via canònica Smad1/5/8 (via Alk2/3) com una via no canònica, cAMP/PKA. La inhibició farmacològica evidencia interaccions entre ambdues rutes, proporcionant una base mecanística per als seus efectes esteroidogènics. S'han identificat dos paràlegs codificants de Gsdf en llobarro (Gsdf1 i Gsdf2), resultat d'una duplicació independent de la duplicació del genoma dels teleòstes. Els seus patrons d'expressió mostren dimorfisme sexual: gsdf1 predomina en testicles durant les fases inicials de desenvolupament, mentre que gsdf2 s'expressa majoritàriament en cèl·lules fol·liculars ovàriques. La regulació hormonal per Fsh, E2 i Amh, juntament amb la presència de motius reguladors en els seus promotors, evidencia la seua integració en el control endocrí de les primeres etapes de la gametogènesi. Finalment, la caracterització funcional dels receptors TGF-ß de llobarro ha revelat una notable plasticitat en la formació de dímers de receptors tipus I/II i en l'activació de vies Smad1/5/8 o Smad2/3, subratllant la versatilitat d'aquest sistema en la regulació gonadal.336Reserva de todos los derechosGametogénesisEsteroidogénesisTeleósteosFisiología de la reproducciónEvoluciónDesarrollo gonadalPubertadFactores gonadalesTesis doctoral10.4995/Thesis/10251/234605Embargado14.- Conservar y utilizar de forma sostenible los océanos, mares y recursos marinos para lograr el desarrollo sostenible