Rodriguez Navarro, SusanaTejada Colón, Ana2025-04-072025-04-072025-02-272025-03-31https://riunet.upv.es/handle/10251/219956[ES] La conexión entre las diferentes etapas que comprenden la expresión génica es esencial para la regulación del proceso. Mip6 en una proteína que participa en varias de estas etapas, regulando la expresión de los genes de respuesta a estrés dependientes de Msn2/4. Mip6 viaja entre el núcleo y el citoplasma gracias a su interacción con Mex67. De esta forma, en condiciones óptimas, Mip6 se une a los transcritos dependientes de Msn2/4, los transporta hacia el citoplasma y participa en mantener sus niveles bajos. Sin embargo, en condiciones de estrés, Mip6 se une preferentemente a los transcritos de proteínas ribosomales y se acumula en gránulos de estrés. Así, los mRNA de respuesta a estrés se metabolizan para ejercer su función. En este trabajo, se ha estudiado el papel de Mip6 en la expresión génica tanto en condiciones óptimas como en condiciones de estrés, centrándonos en su participación en la regulación de la transcripción. Además, también se han caracterizado otras vías de exporte de Mip6 independientes de Mex67. Se han demostrado que Mip6 y Msn2/4 interaccionan genéticamente tanto en condiciones de estrés térmico severo como en estrés oxidativo. El crecimiento del mutante msn2Dmsn4Dmip6D está afectado en ambas condiciones, lo que sugiere que Mip6 participa en un mecanismo de supervivencia celular diferente del de Msn2/4. Además, Mip6 interacciona con la histona desacetilasa Rpd3 física y genéticamente y la presencia de Rpd3 es esencial para el papel de Mip6 en la regulación de los niveles de los transcritos de respuesta a estrés. De esta forma, Mip6 actuaría como un regulador negativo de Rpd3, puesto que sus efectos en la regulación de los niveles de los transcritos son opuestos. Por otro lado, también se ha estudiado la memoria transcripcional en levaduras y la habilidad de las células de responder a una segunda exposición a estrés térmico. Se ha caracterizado tanto la cepa WT como el mutante mip6D. En ambas cepas, se ha observado que dos tercios del genoma se expresa diferencialmente dependiendo de si se trata de una primera o una segunda exposición a estrés térmico. Además, un determinado grupo de genes también presentan diferencias de expresión entre WT y mip6D. Existe una posible señal de exporte nuclear (NES) en el RRM4 de Mip6 que se había sugerido como una vía de exporte independiente de Mex67. Sin embargo, su funcionalidad no estaba clara, dado que al mutar dicha secuencia afectaba a la interacción entre Mip6 y Mex67 y, por tanto, podría afectar al exporte de Mip6 de forma indirecta. En este trabajo, se ha caracterizado la NES de Mip6 y se ha demostrado su capacidad de transportar a Mip6 entre el núcleo y el citoplasma tanto en condiciones óptimas como en estrés. También se han estudiado unos residuos de cisteínas que rodean la secuencia NES y, en concreto, la funcionalidad del residuo C450. Por otro lado, la secuencia homóloga presente en el RRM4 de Pes4, una proteína paráloga de Mip6, no participa en el exporte de Pes4, pero parece que es importante para la localización de Pes4 en gránulos citoplasmáticos. Además, se ha encontrado una segunda secuencia NES en el dominio C-terminal de Mip6 que participa en el transporte de Mip6 en estrés oxidativo inducido por H2O2. Por último, también se ha estudiado la formación de los gránulos de estrés. En concreto, la importancia de algunas regiones intrínsecamente desordenadas del dominio N-terminal de Tif4631. La deleción de las regiones RNA1 y BOX1 afectan los niveles de Tif4631 y el crecimiento celular durante el cambio diáuxico. Esto sugiere la importancia de estas regiones para la función de Tif4631 durante el cambio diáuxico y, probablemente, en la formación de gránulos de estrés.[CA] La connexió entre les diferents etapes que comprenen l'expressió gènica és essencial per a la regulació del procés. Mip6 és una proteïna que participa en diverses d'aquestes etapes, regulant l'expressió dels gens de resposta a estrés dependents de Msn2/4. Mip6 viatja entre el nucli i el citoplasma gràcies a la seua interacció amb Mex67. D'aquesta forma, en condicions òptimes, Mip6 s'uneix als transcrits dependents de Msn2/4, els transporta cap al citoplasma i participa en mantindre els seus nivells baixos. Malgrat això, en condicions d'estrés, Mip6 s'uneix preferentment als transcrits de proteïnes ribosomals i s'acumula en grànuls d'estrés. D'aquesta manera, els mRNA de resposta a estrés són metabolitzats per a exercir la seua funció. En aquest treball, s'ha estudiat el paper de Mip6 en l'expressió gènica, tant en condicions òptimes com en condiciones d'estrés, en concret en la seua participació en la regulació de la transcripció. A més a més, també s'han caracteritzat altres vies d'exportació de Mip6 independents de Mex67. S'ha demostrat que Mip6 i Msn2/4 interaccionen genèticament tant en condicions d'estrés tèrmic agut com en estrés oxidatiu. El creixement del mutant msn2Dmsn4Dmip6D es veu afectat en ambdues condicions, suggerint que Mip6 participa en un mecanisme de supervivència cel·lular diferent a Msn2/4. A més a més, Mip6 interacciona amb la histona desacetilasa Rpd3 física i genèticament i la presència de Rpd3 és essencial per al paper de Mip6 en la regulació dels nivells dels transcrits de resposta a estrés. D'aquesta manera, Mip6 actuaria com un regulador negatiu de Rpd3, ja que els seus efectes en la regulació dels nivells dels transcrits són oposats. D'altra banda, també s'ha estudiat la memòria transcripcional en llevat i l'habilitat de les cèl·lules per a respondre a una segona exposició a estrés tèrmic. S'ha caracteritzat tant la soca WT com la mutant mip6D. En ambdues, s'ha observat que dos terços del genoma s'expressa diferent depenent de si es tracta de una primera o una segona exposició a estrés tèrmic. A més, un determinat grup de gens també presenten diferències d'expressió entre WT i mip6D. Existeix una possible senyal d'exportació nuclear (NES) en el RRM4 de Mip6 què s'havia suggerit com una via d'exportació independent de Mex67. Malgrat això, la seua funcionalitat no era del tot clara ja que mutar aquesta seqüència afectava la interacció entre Mip6 i Mex67 i, per tant, podia afectar a l'exportació de Mip6 de manera indirecta. En aquest treball, s'ha caracteritzat la NES de Mip6 i s'ha demostrat la seua capacitat per a transportar Mip6 entre el nucli i el citoplasma tant en condicions òptimes com en estrés. També s'han estudiat uns residus de cisteïna que rodegen la seqüència NES i, en concret, la funcionalitat del residu C450. Per tant, la seqüència homòloga present en el RRM4 de Pes4, una proteïna paràloga de Mip6, no participa en l'exportació de Pes4, però sembla que és important per a la localització de Pes4 en grànuls citoplasmàtics. A més a més, s'ha trobat una segona seqüencia NES en el domini C-terminal de Mip6 que participa en el transport de Mip6 en estrés oxidatiu induït per H2O2. Per últim, també s'ha estudiat la formació de grànuls d'estrés. En concret, la importància d'algunes regions intrínsecament desordenades del domini N-terminal de Tif4631. La deleció de les regions RNA1 i BOX1 afecten els nivells de Tif4631 i el creixement cel·lular durant el canvi diàuxic. Açò suggereix la importància d'aquestes regions per a la funció de Tif4631 durant el canvi diàuxic i, probablement, en la formació de grànuls d'estrés.[EN] The interconnection of the different steps that comprise gene expression is essential for the regulation of the process. Mip6 is a protein that participates in some of these steps, regulating the expression of the stress-response genes dependent on Msn2/4. Mip6 shuttles between the nucleus and the cytoplasm due to its interaction with Mex67. Therefore, under optimal conditions, Mip6 binds to the Msn2/4-depedent transcripts, transports them to the cytoplasm, and participates in keeping their levels low. However, upon stress, Mip6 rather interact with ribosomal protein transcripts and accumulates in stress granules, so that the stress response mRNAs are metabolized to perform their function. In this work, we study Mip6 role in gene expression under both optimal and stress conditions, focusing on its participation in transcription regulation. Besides, Mip6 Mex67-independent export pathways were also characterized. We demonstrated genetic interactions between Mip6 and Msn2/4 under both severe heat stress and oxidative stress. The growth of the msn2Dmsn4Dmip6D mutant is affected in both conditions, suggesting the participation of Mip6 in a different cell survival mechanism than Msn2/4. Besides, Mip6 interacts with histone deacetylase Rpd3 both physically and genetically, and Rpd3 is essential for Mip6's ability to regulate the levels of stress response transcripts. This suggests that Mip6 functions as a negative regulator of Rpd3, given that their effects on transcription regulation are opposite. Additionally, we studied yeast transcriptional memory and the ability of yeast cells to respond to a second heat stress exposure characterizing both WT and mip6D. Both strains show two-thirds of the genome differentially expressed in a first and a second heat exposure, presenting both strains differences in the expression of a certain subset of genes. A putative Nuclear Export Signal (NES) in Mip6 RRM4 was already suggested to be a Mex67-independent export pathway. However, its functionality was unclear, since point mutations in the sequence also lead to an impairment in the Mip6-Mex67 interaction which could indirectly affect Mip6 export. Here, we characterized Mip6 NES export signal, demonstrating its capacity to transport Mip6 from nucleus to cytoplasm under both optimal and stress conditions. We also studied cysteine residues that surround this NES sequence and C450 functionality. However, the homologous sequence present in Pes4 RRM4, a Mip6 paralogous protein, does not participate in Pes4 export, but it seems to be important for Pes4 localization in cytoplasmic granules. In addition, we found a second NES sequence in the Mip6 C-terminal domain, showing its role in Mip6 transport upon H2O2-induced oxidative stress. Finally, the formation of stress granules was also studied, focusing on the importance of some intrinsically disordered regions in Tif4631 N-terminal domain. The deletion of both RNA1 and BOX1 regions affects Tif4631 levels and cell growth during the diauxic shift, which suggests the importance of these regions in Tif4631 function during the diauxic shift and, likely, with the formation of stress granules.212Reserva de todos los derechosMip6TranscriptionRNA Polymerase IIMRNA exportStressStress responseGene expressionRNA-binding proteinsCellular stress conditionsFunctional genomicsProteínas multifuncionalesGenómica funcionalRespuesta al estrésExpresión génicaExportación de mRNATesis doctoral10.4995/Thesis/10251/219956Abierto03.- Garantizar una vida saludable y promover el bienestar para todos y todas en todas las edades