DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN AGRONÓMICA DE VIROIDES DE CÍTRICOS. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y BIOLÓGICA DE VARIANTES DEL VIROIDE DEL ENANISMO DE LOS CÍTRICOS CDVd.

RESUMEN
      Los cítricos son huéspedes naturales de diferentes especies de viroides, todos pertenecientes a la familia Pospiviroidae. Estudios preliminares para detectar viroides en especies y variedades comerciales dieron resultados erráticos, excepto cuando se utilizaba la especie indicadora cidro Etrog como huésped bioamplificador. Para evitar el uso de este huésped en los ensayos de detección, se desarrolló un método basado en la hibridación northern. El protocolo desarrollado consistía en: (i) extracción de ácidos nucleicos de muestras de corteza recolectadas en diferentes épocas y/o almacenadas en distintas condiciones; (ii) separación de los RNAs en 5% PAGE o 1% agarosa y transferencia a membranas; (iii) hibridación con sondas de DNA marcadas con digoxigenina (DIG) específicas para cada viroide, detección con un anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina y revelado con un substrato quimioluminiscente (CSPD). Con este método se pueden detectar viroides en todas las especies de cítricos ensayadas. La técnica es extremadamente sensible, y acorta el tiempo necesario para la detección fiable de los viroides de cítricos conocidos hasta el momento. 
      La aplicación de esta técnica ha permitido realizar prospecciones en árboles cultivados en distintas regiones citrícolas de Colombia, Perú y Brasil. En limas Tahití de Colombia se han identificado infecciones múltiples con HSVd y CDVd o con CEVd, HSVd y CDVd. Las muestras procedentes del Banco de Germoplasma de Palmira estaban libres de viroides, excepto una fuente de cidro Etrog que estaba infectada con CEVd y CDVd. La caracterización molecular de los aislados de HSVd, CDVd y CEVd recuperados de las muestras analizadas ha mostrado que: (i) todos los aislados de HSVd carecían del motivo de expresión de la caquexia, por lo que se trata de variantes no patogénicas, excepto uno que si contenía dicho dominio; (ii) los aislados de CDVd contenían variantes con alta identidad nucleotídica con la variante de referencia CVd-IIIb; (iii) uno de los aislados de CEVd (CEVdCO) procedente de un cidro Etrog asintomático presentaba una identidad nucleotídica del 96,5% con la secuencia de referencia de la clase A (que engloba las variantes agresivas de este viroide) y del 98,9% con la secuencia de referencia V1 que induce síntomas muy agresivos en cidro Etrog. Los cambios nucleotídicos entre CEVdCO y la variante V1 son: U186A (dominio TR), A235U (dominio V) y AU313-314AG (dominio P). Dada la probada implicación del dominio P en la patogénesis del CEVd, se han obtenido mutantes en las posiciones 313-314 de V1 y CEVdCO para poder demostrar si los cambios identificados en CEVdCO son efectivamente los responsables de que los cidros infectados con dicho aislado de CEVd no manifiesten síntomas.

      El análisis de clones de lima Tahití  procedentes de Perú y Brasil que manifiestan el síndrome del “quebra-galho” (expresión que en portugués significa “rama quebradiza”), caracterizado por el agrietado de la corteza, enanismo y porte abierto de la copa, pero con características productivas deseables, ha mostrado que se encontraban infectados con CEVd, HSVd y CDVd (clones de Perú) o con CEVd y CDVd (clones de Brasil). Los resultados de un estudio realizado en condiciones de campo para determinar si estos viroides son los responsables del síndrome del “quebra-galho” han mostrado que el CEVd induce agrietado de la corteza en lima Tahití después de dos años de efectuada la inoculación, pero se requiere un mayor desarrollo de los árboles, para confirmar que este viroide es efectivamente responsable todos los síntomas característicos del síndrome del “quebra-galho”.
      El viroide del enanismo de los cítricos (CDVd) se encuentra muy difundido en diferentes regiones citrícolas pero sus efectos pasan inadvertidos debido a que no produce síntomas específicos a pesar de haberse probado que causa una reducción del tamaño del árbol. Se ha realizado un estudio exhaustivo dirigido a identificar y caracterizar distintas variantes de este viroide a partir de 33 aislados. El análisis SSCP ha mostrado que cada aislado contenía poblaciones de variantes de secuencia y con la información obtenida se identificó y secuenció la variante más frecuente, y por tanto la más representativa de cada aislado. El análisis filogenético ha permitido establecer su relación con las variantes de referencia (CVd-IIIa, CVd-IIIb y CVd-IIIc). Se seleccionaron cinco secuencias representativas de cada uno de los cinco grupos mayoritarios del árbol filogenético para su caracterización biológica en cidro Etrog. Con los datos de crecimiento y la expresión de síntomas se ha establecido que dos variantes se comportaron como razas agresivas, dos como moderadas y una como muy suave. Los cambios encontrados en estas variantes fueron relacionados con la modulación de los síntomas.
      Para analizar el efecto de los viroides en el comportamiento del cultivo en campo, se realizó el seguimiento y toma de datos de una parcela establecida con árboles de naranjo dulce Washington navel injertado en citrange Carrizo e inoculados con doce fuentes de viroides. El análisis estadístico de los parámetros estudiados (altura del árbol, grosor del tallo, tamaño de la copa y cantidad y calidad de la cosecha) tomados durante cuatro campañas sucesivas mostraron que existían pocas diferencias estadísticas entre los distintos tratamientos.