RESUM En aquest treball de tesi, se presenten diversos estudis experimentals, desenvolupats principalment en peix zebra però també en ostra del Pacífic, que persegueixen la posada a punt de tècniques rellevants per a la utilització d'aquestes dues espècies en el camp de la biomedicina, la toxicogenòmica i l'aqüicultura com a model experimental . En peix zebra, s'han posat a punt i testat: ? Tècniques de vitrificació de teixit d'aleta cabal, de blastòmeres (en microvolums) i de teixit gonadal. ? Tècnica de quimerisme de la línia germinal en estadi MBT, amb una penalització prèvia per radiació ultraviolada dels embrions receptors. ? Tècnica de quimerisme larvari (larves de 48-72 h) utilitzant com a donants cèl.lules testiculars prèviament criopreservades obtingudes d'individus adults . ? Tècnica de trasplantament nuclear utilitzant com a donants nuclis de cèl•lules somàtiques adultes i larvàries. ? Tècnica d’electroactivació en medi iònic d'oòcits de peix zebra. En ostra del Pacífic, s’han posat a punt i testat: ? Avaluació dels canvis estacionals en la qualitat oocitaria i espermàtica en ostra del Pacífic. ? Tècnica d’electrofusió zigòtica de zigots obtinguts per fecundació in vitro en ostra del Pacífic. Tècniques de vitrificació de teixit d'aleta cabal, de blastòmeres (en microvolúms) i de teixit gonadal. En relació amb aquest grup de tècniques, assenyalar el diferent nivell de dificultat de cada una d'elles i fins i tot dels resultats assolits. Així, la vitrificació de teixit de l'aleta cabal no ha suposat problema addicional respecte a l'aplicació d'aquesta tècnica en els últims anys a teixits epitelials de cinc espècies de mamífers, el que dóna idea de la versatilitat en l'ús d'aquesta tècnica de vitrificació bàsica. Per contra, la criopreservació de blastòmeres ha suposat un veritable repte, ja que els patrons de permeabilitat cel•lular en aquesta espècie aquàtica és molt diferent a la característica en mamífers, el que obliga en principi i seguint els mètodes de vitrificació més convencionals (permeació intracel•lular de crioprotectors), a prolongar excessivament els temps de permeació previs a la vitrificació. Un enfocament innovador ha permès aconseguir la vitrificació de blastòmeres aïllades amb relativament elevada viabilitat cel•lular posterior, quan la vitrificació es va realitzar en microvolums (0.25µl) i sense pretendre la permeació del crioprotector a l'interior de les cèl•lules . Pel que fa a la criopreservació de teixit gonadal, s'han testat tres procediments, dos de congelació i un de vitrificació, dels que clarament aquest últim ha donat els millors resultats . Certament, el procediment de vitrificació ha resultat molt més eficient quan s'ha aplicat sobre petits fragments de teixit testicular que quan es va aplicar després de la seva tripsinització. Tècnica de quimerisme de la línia germinal en estadi MBT, amb una penalització prèvia per radiació ultraviolada dels embrions receptors. Pel que fa a les tècniques de quimerisme de la línia germinal en estadi MBT, s'han d'assenyalar diverses qüestions. En primer lloc, que el tractar els embrions receptors amb radiació ultraviolada (UV), no és l'únic requisit per aconseguir els millors resultats de quimerisme de la línia germinal. S’ha de complementar aquest efecte amb l'evitació del xoc osmòtic que suposa la utilització de medis de 30 mOsm/kg per a la micromanipulació. D'altra banda, és rellevant assenyalar la detecció d'una sensibilitat diferencial al tractament per UV en funció de la estirp de peix zebra utilitzada, sent l'estirp gold més sensible que la wild en referència a això. Pel que fa a la tècnica de quimerisme utilitzant blastòmeres vitrificades en microvolums, hauran així mateix de resoldre's en el futur la desorganització morfològica de l'embrió receptor provocada per l'augment de mida de les blastòmeres després de la seva desvitrificació i el consegüent tamany excessiu de les pipetes de micromanipulació . Tècnica de quimerisme larvari (larves de 48-72 h) utilitzant com a donants cèl.lules testiculars prèviament criopreservades obtingudes d'individus adults . Aquesta tècnica és la conseqüència lògica de la criopreservació de teixit testicular abans indicada, ja que es requereix per a que aquestes cèl•lules testiculars, concretament les espermatogònies, s'integrin en la línia germinal de l'individu receptor. S'han utilitzat larves de 48-72 h assumint que en aquest estadi el sistema immunitari no s'ha establert plenament i, per tant, no atacarà les cèl•lules trasplantades. Els resultats tècnics relatius a micromanipulació, supervivències larvàries i desenvolupament fins adult han estat plenament satisfactoris, no així els de quimerisme de la línia germinal, ja que no s'ha observat quimerisme de la línia germinal en cap espècimen. D'entre les raons que justificarien aquesta mancança, una és la que ressalta com més plausible a judici dels autors: la possible disincronia entre les pautes temporals de desenvolupament de les espermatogònies i aquelles pròpies del teixit testicular, que pel sembla són més ràpides que el primer. Tècnica de trasplantament nuclear utilitzant com a donants nuclis de cèl•lules somàtiques adultes i larvàries. Aquest grup de tècniques és potser més original i de major recorregut de cara al futur d'entre les aquí contemplades. Les aportacions referents a això que s'han aconseguit amb aquesta tesi podrien classificar-se en diversos ítems. En primer lloc, el fet d'haver aconseguit el trasplantament nuclear sobre oòcits no activats sense necessitat de localitzar el micròpil, sent a més que en cap de les tres alternatives de trasplantament nuclear s'ha requerit el decorionat dels oòcits receptors. En segon lloc, haver pogut comparar que els efectes sobre el desenvolupament embrionari posterior i l'abast del mateix tenen en qualsevol d'aquestes alternatives de trasplantament nuclear i que l'oòcit hagi estat activat mitjançant la seva fertilització amb un espermatozoide no radiat, amb un radiat o tan només per l'efecte estimulant del contacte amb l'aigua del sistema. En aquest mateix sentit, s’ha d’assenyalar que la punció de la pipeta de trasplantament nuclear sense injectar nucli cel•lular algun així com l’exposició a aigua de sistema, no suposen en cap cas el desenvolupament posterior partenogenota, el que ens permet afirmar el paper rellevant que la presència del nucli donant exerceix sobre la capacitat de desenvolupament embrionari. En tercer lloc s'ha pogut desestimar la possible utilitat de l’envelliment oocitari com a factor promotor de l'eficàcia d'activació oocitària, a diferència, en aquest cas notable, del conegut en mamífers. Es mereix menció especial a una aproximació a l'estudi del imprinting gamètic i fins i tot de la possible tècnica alternativa per a la obtenció d'animals transgènics, que es deriva de la utilització com a donant en trasplantament nuclear, sobre oòcit no enucleat, de cèl•lules obtingudes per cultiu de larves ginogenotes haploids obtingudes per radiació ultraviolada d'espermatozoides. La potencial importància d'aquesta tècnica només ha pogut ser avaluada molt preliminarment en aquesta tesi, encara que en aquests moments ja s'estan desenvolupant nous treballs al respecte. Tècnica d’electroactivació en medi iònic d'oòcits de peix zebra. Respecte a aquesta tècnica, el més rellevant que es deriva d'aquests estudis és potser la facilitat que suposa el poder utilitzar medis iònics per electroactivació, i amés, sent que en pràcticament tots els experiments d’electroactivació recents dels que es té coneixement, el mitjà d’electroactivació ha estat quasi sempre no conductor. D'altra banda, el millor protocol d’electroactivació (un pols cuadrat de 5.4 V i 20µs de durada) permet fins a un 60% d'oòcits activats quan aquests no han estat prèviament micromanipulats. Malauradament quan aquestes seqüències de polsos es van assajar sobre oòcits trasplantats nuclearment, la quasi totalitat d'ells van resultar llisats. Això obligarà en el futur a redefinir els polsos elèctrics quan es pretenguin acoblar a la tècnica de trasplantament nuclear. Avaluació dels canvis estacionals en la qualitat oocitària i espermàtica en ostra del Pacífic. Encara que aquest apartat no es refereix al desenvolupament de cap tècnica de micromanipulació, resultava imprescindible conèixer els mesos de l'any en què es disposaria de gàmetes a quantia i qualitat suficient per, precisament, poder treballar en tècniques embriològiques o de micromanipulació en aquesta espècie. Els resultats han estat absolutament concloents, de tal manera que només en els mesos de juliol a octubre, ambdós inclosos cal esperar que es disposi de gàmetes, mentre que a la resta de l'any tal disponibilitat resulta com a mínim incerta. Tècnica d’electrofusió zigòtica de zigots obtinguts per fecundació in vitro en ostra del Pacífic. En base a l'anterior, durant els mesos assenyalats, es van realitzar assaigs de electrofusió zigòtica com a pas previ a la possible obtenció d'ostres tetraploides. Referent a això, alguns dels resultats obtinguts han resultat interessants. D'una banda, i amb la possibles de poder-se estendre a altres espècies marines, s'ha comprovat que l'aplicació de polsos elèctrics (en aquest cas de fusió cel•lular ) pot donar-se en mitjans altament conductors i d'elevada osmolaritat, en aquest cas aigua de mar. D'altra banda, la taxa de fusió cel•lular en estadi zigòtic ha estat altament eficient, amb unes mortalitats molt reduïdes i amb elevades taxes de desenvolupament fins a larva d'estadi D (24 h de cultiu post-fusió). També s'ha pogut comprovar que la fusió no altera de manera significativa els patrons de divisions cel•lulars posteriors, transcorreguts 25-30 min d'aplicació del pols, el que indicaria la pràctica absència de danys ocasionats per el pols sobre els embrions primerencs. La no disponibilitat de les instal.lacions i l'aliment requerits per a que el grau de desenvolupament arribi a estadis clau com "spat" i fins i tot adult impedeix, per ara, avaluar la ploidía dels espècimens així obtinguts.