La mosca mediterrània de la fruita, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera:Tephritidae), és considerada la principal plaga dels cultius fruiters a nivell mundial. Actualment, la vigència del control químic com mesura prioritària en el maneig d'aquesta plaga està seriosament compromesa, tant per restriccions legals (prohibició de matèries actives) i socials (tendències de consum) com per limitacions intrínseques del mètode (resistències). Per tant, el desenvolupament i implementació de mètodes alternatius de control que siguen respectuosos amb el medi ambient és cada vegada més important.

Els productes derivats de Bacillus thuringiensis (Berliner) (Bt) han sigut utilitzats amb èxit en el control de plagues durant més de mig segle. El poder insecticida d'aquest bacteri resideix fonamentalment en un grup divers de proteïnes denominades delta-endotoxines. Existeixen més de 3000 insectes susceptibles a alguna d'aquestes toxines, a més els productes Bt són altament selectius i respectuosos amb el medi ambient. No obstant això, fins al moment no s'ha identificat cap delta-endotoxina altament insecticida sobre C. capitata ni sobre altres mosques de la fruita (Tephritidae).

La present tesi doctoral té per objecte l'avaluació de B. thuringiensis i les seues delta-endotoxines com possibles agents de control de C. capitata. Per a això, s'ha realitzat una anàlisi exhaustiva de la biodiversitat de B. thuringiensis en l’agroecosistema dels cítrics, un hàbitat en el qual l'insecte diana (C. capitata) i l'entomopatogen (B. thuringiensis) han coexistit de forma continuada. L'aplicació de diverses tècniques (microscopia, electroforesi de proteïnes, detecció de gens de delta-endotoxines) ha demostrat que aquest agroecosistema és un important reservori de B. thuringiensis, tant per la seua abundància com per la seua diversitat. No obstant això, cap dels aïllats d'aquesta col·lecció ni d'altres col·leccions (en total 905 soques) mostra una alta activitat insecticida sobre C. capitata quan extractes crus del seu cultiu (espores i cristalls o sobrenadant) són assajats.

El mecanisme pel qual les delta-endotoxines són tòxiques sobre les espècies susceptibles és complex i comprèn diverses etapes: en síntesi, els cristalls de delta-endotoxines són ingerits i es solubilitzen en el tracte intestinal donant lloc a protoxines solubles que són processades proteolíticament pels enzims digestius a toxines actives que, després de travessar la membrana peritròfica, interactuen amb la membrana epitelial desencadenant una sèrie d'esdeveniments que condueixen a la mort de l'insecte. Limitacions o alteracions en cadascuna d'aquestes etapes poden explicar que una delta-endotoxina particular tinga o no propietats insecticides sobre una determinada espècie d'insecte. En aquest sentit, com reacció a l'aparent insensibilitat que mostra C. capitata cap als cristalls de delta-endotoxines, s’ha abordat el tractament in vitro d'aquests cristalls emulant alguns passos del citat mecanisme d'acció així com l'avaluació de la seua activitat biològica sobre C. capitata. Així, la pressolubilització de les protoxines d'una selecció de 41 soques de B. thuringiensis i una soca de Bacillus sphaericus (Meyer i Neide) ha mostrat que per a les soques d'una de les subespècies, subsp. israelensis (Bti), aquest tractament produeix un guany de funció biològica sobre les larves de C. capitata. És a dir, almenys per a aquesta subespècie, la falta d'activitat dels cristalls de delta-endotoxines es deu a la insuficient solubilització en el tracte intestinal, possiblement a causa de la baixa alcalinitat d’aquest. Addicionalment, la predigestió d'aquestes protoxines amb una font exògena de proteases (extractes de Culex pipiens L., espècie susceptible a Bti de forma natural) produeix un augment significatiu de la seua activitat insecticida (CL50 31.26 µg/cm2). Aquest fet suggereix que el processament que pateixen les protoxines de Bti a l'intestí de C. capitata tampoc és l'adequat per a promoure la seua acció citotòxica.

Bti produeix una barreja de 4 protoxines majoritàries: Cry4A, Cry4B, Cry11A i Cyt1A. La utilització d'una soca recombinant que produeix la protoxina Cyt1Aa individual ha demostrat que aquesta protoxina és el factor determinant de l'activitat que exhibeix Bti sobre C. capitata. A més, aquesta és la primera vegada en la qual s'identifica una delta-endotoxina única que siga tòxica sobre aquesta espècie. L'activitat de Cyt1Aa és la més alta registrada en aquest estudi (CL50 4.93 µg/cm2), encara que tan sols quan els seus cristalls són prèviament solubilitzats i únicament sobre larves (sobre adults produeix efectes subletals). Aquesta circumstància restringeix el seu ús potencial en el control de la plaga.

Les toxines Cyt interactuen directament amb certs fosfolípids de membrana, en canvi les toxines Cry precisen de receptors específics a l'epiteli intestinal per a resultar citotòxiques. Els resultats obtinguts amb soques nadiues de B. thuringiensis suggereixen que C. capitata manca dels receptors adequats, almenys per a les proteïnes Cry assajades. A fi de salvar aquesta limitació, aquesta tesi proposa un nou mètode basat en el desenvolupament de toxines de fusió per a les quals l'afinitat que de forma natural mostren les toxines Cry cap al seu receptor és substituida per la fusió a les mateixes d'anticossos amb capacitat d’unió específica a proteïnes de membrana de C.capitata. Com aquest mètode exigiria una intensa labor i suposaria un elevat cost econòmic abans de poder confirmar la seua viabilitat, s'ha posat en pràctica un sistema model per a avaluar l'estratègia proposada. Els dos elements clau del sistema model són: larves transgèniques de Drosophila melanogaster (Meigen) que expressen GFP a l'epiteli intestinal i proteïnes de fusió entre diferents seccions de la protoxina Cry1Ab i la regió variable d'un anticòs de cadena pesada específic contra GFP (VHH anti-GFP). S'han desenvolupat 4 variants proteiques i s'ha determinat el patró d'expressió de GFP en la línia de D. melanogaster; no obstant això, deficiències en la unió de les toxines de fusió al seu antigen (GFP) han impedit confirmar de moment la validesa d'aquesta estratègia. Addicionalment, i en previsió de la potencial aplicació d'aquesta tècnica a C.capitata, s'ha efectuat una primera prospecció de possibles proteïnes de membrana candidates per a ser receptors de proteïnes de fusió. Existeixen almenys 160 polipèptids en la membrana “en vora de raspall” de l'epiteli intestinal d'adults de C. capitata i de les 11 proteïnes estudiades s'han identificat almenys 3, V-ATPasa / subunitats A i B, i alfa-tubulina. La idoneïtat d'aquestes o altres proteïnes com candidates per a la nova estratègia hauria de ser avaluada en futurs estudis.

Com a conclusió, aquest treball ha identificat una delta-endotoxina de B. thuringiensis, Cyt1Aa, activa contra C. capitata, encara que és necessari valorar la seua potencial aplicació en el control d'aquesta plaga. D'altra banda, s'ha elaborat i caracteritzat exhaustivament una col·lecció de soques de B. thuringiensis que, si bé mostren poca o cap activitat contra l'espècie diana, posseeixen un elevat potencial en el control d'altres plagues. Finalment, malgrat que l'estratègia encara no ha estat validada, s'ha obert una nova via en el desenvolupament de toxines recombinants per al control de C. capitata o altres plagues d'importància agrícola.