Caracterización de modelos de toxicidad por RNA para el rastreo de moléculas con potencial terapéutico en Caenorhabditis elegans

Abstract

[EN] Huntington's disease (HD) is a rare neurodegenerative pathology that presents an autosomal dominant inheritance. HD is caused by the presence of an abnormal number of CAG triplets (CAG expansion mutation) in the first exon of the huntingtin gene (htt), which encodes a polyglutamine tandem. The presence more than 39 repetitions in the coding zone of the htt gene, has an impact on the protein, folding incorrectly and acquiring a toxic function. The mutant huntingtin (mHtt) initiates a process of aggregation in certain areas of the brain, mainly the striated nucleus. In the patients, it manifests affectating in 3 levels: cognitive, motor (Involuntary strong movements or Korea) and psychiatric.

However, despite being a monogenic disease, understanding its etiology and finding therapeutic targets is complicated. Not only in HD, but in all the diseases due to CAG expansion, there is a toxicity component at the RNA level. Therefore, we propose to separate both components (RNA and protein), generating models in Caenorhabditis elegans (C. elegans) without expression of mutant protein. In that way, we can look for molecules that reduce the specific RNA-mediated toxicity RNA that contains CAGs.

C. elegans allows modeling aspects of this disease that allow us to carry out a massive drug screening aimed at detecting a decrease in the toxicity produced.

In the laboratory where I will develop my final degree project, tissue-specific RNA toxicity models have been generated. So mainly, my TFG, is framed in assessing the locomotor level toxicity of the models previously generated and selecting the model that presents a more robust phenotype to carry out the tracking. The models developed through the Gateway Technology (Invitrogen) and MosSCI (ref) are: 1. Expression of a transgene with 122 CAG in muscle under the control of the promoter of the myo-3 gene (abbreviated as myo-3p :: 122CAG) 2. Expression of a transgene with 153 CAGs in the nervous system under the control of the rab-3 gene promoter (abbreviated as rab-3p :: 153CAG) 3. Expression of a transgene with 144 CAGs in GABAergic neurons under the control of the unc-25 gene promoter (abbreviated as unc-25p :: 144CAG) 4. Expression of a transgene with 22 CAGs in GABAergic neurons under the control of the unc-25 gene promoter (abbreviated as unc-25p :: 22CAG)

To evaluate the mobility of the animals, motility tests in liquid medium will be carried out. One of the most used is the Thrashing, which allows to analyze the movement of beating animals in a period of time. It is proposed to count the number of Thras / min in the different strains manually. Taking advantage of the possibilities of automatically evaluating locomotion, we will use the Worm MicroTracker device that the group has and a prototype that is being developed by the Active Vision group of the Robotics area of the University Institute of Automation and Industrial Computing (ai2) of the University Polytechnic of Valencia led by the professor Antonio José Sanchez Salmerón to try to reproduce and reinforce the data acquired manually.

[ES] La enfermedad de Huntington (EH) es una patología rara, neurodegenerativa, que presenta una herencia autosómica dominante. La EH está causada por la presencia de un número anormal de tripletes CAG (mutación de expansión de CAG) en el primer exón del gen de la huntingtina (htt), que codifican un tándem de poliglutaminas. La presencia de más de 39 repeticiones en la zona codificante del gen htt, tiene un impacto sobre la proteína, plegándose incorrectamente y adquiriendo una función tóxica. La huntingtina mutante (mHtt) inicia un proceso de agregación en ciertas áreas del cerebro, principalmente, el núcleo estriado. Ello, en los pacientes se manifiesta con afectación en 3 niveles: cognitivo, motor (Movimientos fuertes involuntarios o Corea) y psiquiátrico.

Sin embargo, a pesar de ser una enfermedad monogénica, comprender su etiología y encontrar dianas terapéuticas es complicado. No solamente en EH, sino en todas las enfermedades debidas a expansiones de CAG, hay un componente de toxicidad a nivel de ARN. Por lo que nos proponemos separar ambos componentes (ARN y proteína), generando modelos en Caenorhabditis elegans (C. elegans) sin expresión de proteína mutante. De esa manera, podremos buscar moléculas diana que alivien la toxicidad específica mediada por ARN que contiene CAGs. C. elegans permite modelizar aspectos de esta enfermedad que nos permitan llevar a cabo un rastreo de fármacos masivo destinado a detectar una disminución de la toxicidad producida.

En el laboratorio donde desarrollaré mi trabajo final de grado, se han generado modelos de toxicidad por ARN específicos de tejido. Por lo que principalmente, mi TFG, se enmarca en evaluar la toxicidad a nivel locomotor de los modelos generados previamente y seleccionar el modelo que presente un fenotipo más robusto para llevar a cabo el rastreo. Los modelos desarrollados mediante la Tecnología Gateway (Invitrogen) y MosSCI (Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans) son: 1. Expresión de un transgén con 122 CAG en músculo bajo el control del promotor del gen myo-3 (abreviado como myo-3p::122CAG) 2. Expresión de un transgén con 153 CAG en sistema nervioso bajo el control del promotor del gen rab-3 (abreviado como rab-3p::153CAG) 3. Expresión de un transgén con 144 CAG en neuronas GABAérgicas bajo el control del promotor del gen unc-25 (abreviado como unc-25p::144CAG) 4. Expresión de un transgén con 22 CAG en neuronas GABAérgicas bajo el control del promotor del gen unc-25 (abreviado como unc-25p::22CAG)

Para evaluar la movilidad de los animales, se realizarán ensayos de motilidad en medio líquido. Uno de los más usados es el Thrashing, el cual permite analizar el movimiento de ''batido'' de los animales en un periodo de tiempo. Se plantea contabilizar el número de Thras/min en las diferentes cepas manualmente. Aprovechando las posibilidades de evaluar la locomoción de manera automatizada, se empleará el aparato Worm MicroTracker del cual dispone el grupo y un prototipo que está desarrollando el grupo de Visión Activa del área de Robótica del Instituto universitario de Automática e Informática Industrial (ai2) de la Universidad Politécnica de Valencia liderado por el catedrático Antonio José Sánchez Salmerón para intentar reproducir y reforzar los datos adquiridos manualmente.