Estudio de posibles dianas del microRNA miR-99a en cáncer de mama triple negativo

Abstract

[ES] El cáncer es la segunda enfermedad más prevalente en todo el mundo actualmente, con un número de afectados que ha duplicado las cifras de hace diez años. En concreto, el cáncer de mama es el tipo de tumor que se diagnostica con más frecuencia en mujeres, siendo el subtipo triple negativo el más agresivo y con peor pronóstico debido a la ausencia de dianas a las que dirigir posibles tratamientos, puesto que estos tumores expresan bajos niveles de los receptores PGR, ER y HER2. Debido a esto, las posibilidades terapéuticas de estas pacientes se restringen a los quimioterapéuticos convencionales, como son la doxorrubicina y algunos taxanos. Uno de los factores de mal pronóstico en cáncer de mama triple negativo es el desarrollo de resistencias a quimioterapia. En ese sentido, se han realizado diversos estudios con el fin de revelar los mecanismos moleculares que dan lugar a la aparición de quimioresistencias. Entre otros, se ha descrito que los microRNAs juegan un papel fundamental no solo en la progresión de la enfermedad, sino también en la aparición de resistencias, ya que pueden tener como diana oncogenes o genes supresores tumorales. De este modo, ya se ha podido clasificar algunos microRNAs como oncomiRs o microRNAs antitumorales. El presente trabajo parte de un estudio previo donde se realizó un microarray de expresión de microRNAs en el que se compararon los perfiles de expresión de microRNAs en líneas celulares de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 sensibles y resistentes a doxorrubicina. Dicho análisis reveló que el microRNA miR-99a-5p, entre otros, está diferencialmente expresado, mostrando unos niveles de expresión significativamente más bajos en las líneas resistentes, lo cual sugiere su posible papel antitumoral. Dada la posible implicación del microRNA miR-99a-5p en la resistencia a doxorrubicina, en esta investigación se planteó averiguar cuáles son los mecanismos moleculares por los cuales está implicado. Para ello, se llevó a cabo una búsqueda de potenciales dianas teóricas mediante el uso de herramientas informáticas de predicción de dianas y se identificó a COX2 y ABCG2 como posibles dianas. Además, se realizó un análisis bibliográfico y se confirmó que muchos estudios plantean que tanto COX2 como ABCG2 son genes relacionados con un mal pronóstico de la enfermedad por su implicación en el desarrollo de resistencias. Con el fin de determinar si miR-99a-5p regula la expresión de COX2 y ABCG2, se llevaron a cabo ensayos de sobreexpresión e inhibición del microRNA y posteriormente se determinaron los niveles de expresión de las hipotéticas dianas a nivel de RNA mensajero mediante PCR a tiempo real, y a nivel de proteína mediante Western Blot. Finalmente, se llevó a cabo el ensayo del gen reportero para determinar si miR-99a-5p regula la expresión de COX2 y ABCG2 de forma directa o indirecta.

[EN] Currently, cancer is the second most prevalent disease worldwide, with a number of affected patients that has been doubled in the last decade. Specifically, breast cancer is the type of tumour more frequently diagnosed in women, being the triple negative subtype characterised by its agressivity and poor prospects due to the absence of candidate targets for treatment, since this type of tumour lacks the PGR, ER and HER2 receptors. Thereby, therapeutic alternatives for these patients are restricted to unspecific conventional chemotherapies, such as doxorubicin and some taxanes. The development of chemotherapy resistances is one of the poor prognosis factors in triple negative breast cancer. Several studies have been conducted in order to reveal the molecular mechanisms underlying the development of chemoresistance. MicroRNAs have been described to play an essential role not only in the progression of the disease, but also in the development of chemoresistances, since microRNAs can target oncogenes or tumour supressor genes. In fact, many microRNAs have been already classified as oncomiRs or tumour supressor microRNAs. This work is the continuation of a previous study, in which a microRNAs microarray was performed to compare the expression profiles of microRNAs between sensitive and resistant to doxorubicin triple negative breast cancer MDA-MB-231 cell lines. This analysis revealed that microRNA miR-99a-5p is differentially expressed, exhibiting significantly lower levels of expression in the resistant cell line, suggesting a tumour suppressing role. Based on the suggested implication of microRNA miR-99a-5p in resistance to doxorubicin, the present investigation aimed to reveal the molecular mechanisms that imply miR-99a-5p in the development of chemoresistance. For that purpose, a search of possible miR-99a-5p targets was conducted by the use of bioinformatic target prediction tools, being COX2 and ABCG2 identified as feasible targets. In order to determine whether miR-99a-5p regulates the expression of COX2 and ABCG2, the microRNA was overexpressed and inhibited and afterwards the expression levels of the hypothetical targets were determined by real time PCR and by Western Blotting in order to assess the changes at gene and protein levels. Eventually, the reporter gene assay was performed in order to determine whether miR-99a regulates COX2 and ABCG2 expression in a direct or indirect manner.