Caracterización de células mieloides supresoras (MDSCs) en pacientes con melanoma metastático

Abstract

[ES] El melanoma es una neoplasia originada en los melanocitos curable durante la etapa inicial pero que, sin tratamiento, es de rápido avance, pudiendo provocar metástasis. Normalmente, el melanoma se diagnostica en etapas tempranas, por lo que la escisión quirúrgica representa el tratamiento de elección. Sin embargo, aproximadamente el 10% de los casos de melanoma se diagnostican en una etapa avanzada, y no son resecables o ya son metastásicos. Es para estos pacientes para los que actualmente se recurre a las terapias antitumorales dirigidas molecularmente o bien a la inmunoterapia. Asimismo, diversos estudios sobre el melanoma confirman que el microambiente tumoral es un elemento clave en el pronóstico del paciente y una posible diana sobre la que dirigir los tratamientos. Es por esto por lo que en el presente proyecto se caracterizan células mieloides supresoras (MDSCs), en concreto, macrófagos, presentes en el microambiente de muestras de melanoma metastásico.

Los macrófagos se caracterizan por su elevada plasticidad dependiente de las señales del ambiente externo y pueden modificar su metabolismo o bien para promover la cicatrización/crecimiento (macrófagos M2/antiinflamatorios), o bien para la inhibición/muerte (macrófagos M1/proinflamatorios). Generalmente, la presencia macrofágica en el melanoma está asociada a un mal pronóstico puesto que los macrófagos asociados al tumor (TAM), generalmente con fenotipo M2, participan fomentando el crecimiento del tumor, así como suprimiendo la actuación del sistema inmune en este.

Este estudio se basa en el ensayo mediante inmunohistoquímica (IHC) y PCR cuantitativa (qPCR) de 30 muestras de pacientes con melanoma metastásico. Así pues, se estudia la presencia de 8 marcadores característicos del fenotipo antiinflamatorio de los macrófagos: ARNT2, CCL19, CD163L1, ADGRE1, RGS16, SOCS2, MMP12 y BMP6, usando como marcador característico para la identificación de infiltrado monocitario por IHC el CD68, y para el análisis de la expresión relativa por qPCR, el housekeeping GAPDH y un cDNA de referencia comercial.

La evaluación de las muestras por IHC permitió conocer que la regulación positiva en células tumorales de las moléculas BMP6, CCL19 y MMP12, así como la reducida expresión de ARNT2, RGS16 y SOCS2, caracterizaba las muestras de estudio. Asimismo, se confirmó que ADGRE1 seguido de CD163L1 son los marcadores para macrófagos más específicos de todos los estudiados. Por otro lado, el estudio por qPCR demostró que los genes CCL19 y ADGRE1 presentaban una expresión relativa incrementada, mientras que RGS16 mostraba infraexpresión en las muestras evaluadas. El estudio de las posibles correlaciones de los marcadores en las células tumorales demostró nuevos patrones de asociación hasta el momento no reportados, mientras que el estudio de las correlaciones en macrófagos corroboró el perfil de coexpresión esperado por tratarse de marcadores de macrófagos antiinflamatorios.

Con todo ello, este estudio demuestra el alto contenido monocitario presente en muestras de melanoma metastásico, así como la expresión de los marcadores evaluados no sólo en macrófagos, sino también en células tumorales, indicando, por tanto, el alto potencial de estos como posibles dianas terapéuticas para el tratamiento del melanoma.

[EN] Melanoma is a neoplasm originated in melanocytes which can be curable at initial stages but, without treatment, it has a rapid progression, being able to cause metastasis. Usually, melanoma is diagnosed at early stages, therefore surgical excision represents the treatment of choice. However, approximately 10% of melanoma cases are diagnosed at an advanced stage and are not resectable or they are metastatic. Nowadays, for this type of patients, is common to use molecularly directed antitumor therapies or immunotherapy. Moreover, studies on melanoma confirm that tumor microenvironment is a key element in the study of patient¿s prognosis and a possible target to direct treatments for immunostimulation and removal of this tumor. That is why the present project characterizes myeloid-derived suppressor cells (MDSCs), specifically, macrophages, present in the tumor microenvironment of melanoma samples.

Macrophages are characterized by their high plasticity dependent on signals from the external environment and may also modify their metabolism either promote healing/growth (M2 macrophages/anti-inflammatory), or inhibition/death (M1 macrophages/proinflammatory). Generally, presence of macrophages in melanoma is associated with poor prognosis due to tumor-associated macrophages (TAM), which generally have an M2-type phenotype, join in some ways to promote tumor growth, as well as suppressing immune system on it.

This study is based on immunohistochemistry (IHC) and real-time quantitative PCR (qPCR) assay of 30 samples from patients with metastatic melanoma. Thus, we studied the presence of 8 characteristic markers of anti-inflammatory phenotype of macrophages: ARNT2, CCL19, CD163L1, ADGRE1, RGS16, SOCS2, MMP12 and BMP6, using CD68 as a marker for IHC assay for the identification of monocytic infiltrate, and the housekeeping GAPDH and a commercial reference cDNA for the analysis of relative expression by qPCR.

IHC analysis showed us that our samples were characterized by the upregulation of BMP6, CCL19 and MMP12 molecules, as well as downregulation of ARNT2, RGS16 and SOCS2 in tumor cells. Likewise, it was confirmed that ADGRE1 followed by CD163L1 are the most specific markers for macrophages among the studied. On the other hand, qPCR analysis showed that CCL19 and ADGRE1 genes were overexpressed, whereas RGS16 was underexpressed in the samples evaluated. The study of markers correlations in tumor cells showed new patterns of association so far not reported, while the study of gene correlations on macrophages corroborated the expected coexpression profile for being markers of anti-inflammatory macrophages.

Therefore, this study shows the high monocyte content present in metastatic melanoma samples as well as the expression of the evaluated markers not only in macrophages, but also in tumor cells, showing the high potential of these as possible therapeutic targets for the treatment of melanoma.