Obtención de plantas androestériles de tomate (Solanum lycopersicum) por edición de un gen mediante CRISPR/Cas9

Abstract

[ES] El control de la floración y la fructificación en especies de interés agronómico suscita el interés de los investigadores y mejoradores vegetales desde hace años, debido al impacto económico y la importancia social de este tipo de plantas. En esta línea, el tomate es una de las especies hortícolas más importantes de todo el mundo, por lo que nuestro laboratorio se ha marcado como objetivo dilucidar las bases moleculares y genéticas del desarrollo de la antera en esta especie. Este trabajo pretende identificar y caracterizar uno de los genes que controla el desarrollo de las anteras en tomate, y, en concreto, que regula la dehiscencia de las mismas y, por tanto, la liberación del polen. La mutación de este tipo de genes generaría plantas androestériles, es decir, cuya parte masculina de la flor es incapaz de desarrollar su función adecuadamente. El interés de este tipo de plantas reside en su utilidad en programas de mejora vegetal, obtención de híbridos comerciales y otros procesos similares, para los cuales muchas veces es necesario eliminar manualmente las anteras, lo cual conlleva un desembolso de tiempo y dinero muy importantes. Para lograr nuestro objetivo, aprovechamos la información generada en la especie modelo Arabidopsis thaliana, en donde se han identificado un gran número de genes que controlan el desarrollo de la antera, por lo que pretendemos utilizar esta información para identificar homólogos funcionales en tomate. En primer lugar, llevaremos a cabo un análisis bioinformático de homología de secuencia (pues habitualmente una similitud en la secuencia de los genes está relacionada con el desarrollo de una función equivalente). Una vez finalizada la búsqueda y caracterización de genes candidatos, analizaremos los patrones de expresión de estos en diversos tejidos de la planta mediante un análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Seleccionaremos aquellos genes que se expresen en la flor, en diversos estadios del desarrollo de la misma. Posteriormente, generaremos una construcción CRISPR/Cas9, mediante el ensamblaje de los módulos que lo integrarán (RNA guía, gen hCas9 y gen de selección NptII). La introducción de esta construcción en planta mediante transformación genética nos permitirá editar el gen de interés y provocar una pérdida de función en las plantas transformadas con esta construcción.

[EN] Abstract: The flowering and fruiting development regulation in plants of agronomic interest has attracted the interest of plant researchers and breeders for years, due to the economic impact and social importance of this kind of plants. Tomato is one of the most important horticultural crops in the world. In this context, our group is studying the molecular and genetic bases of the anther development in this species.

In this work, we aim to identify and characterize genes that control anther development. We will focus on the ones that regulate the dehiscence of the anthers, and, therefore, the release of pollen.

The mutation of these of genes would generate androsterile plants -plants whose stamens are unable to perform its function properly-. These plants are used in plant breeding programs or other processes in which it is necessary to manually remove the anthers, preventing undesired crosses, which entails a significant outlay of time and money.

To achieve our objective, we will use previous researches in the model species Arabidopsis thaliana, in which many genes that control the anther development have been identified. We intend to use this information to identify the tomato functional homologous.

First, we will carry out a sequence homology bioinformatic analysis -since a similarity in the gene sequence is usually related to the development of an equivalent function-. Once the candidate genes are selected and characterized, we will measure their expression patterns through a quantitative real-time PCR analysis (RT-qPCR), selecting the ones which are expressed in the flower, at different stages of its development.

Finally, we will generate a CRISPR/Cas9 construction by assembling the different modules -guide RNA, hCas9 gene and NptII selection marker-. This plasmid will be used to transform tomato plants, allowing us to edit our gene of interest and causing a knock-out in the function. The main objective of this process is to obtain androsterile tomato plants (since these mutants would present indehiscent anthers).