Anti-CRISPR protein AcrIIA4 as a novel tool to control CRISPR/Cas9-mediated gene editing and activation in Nicotiana benthamiana

Abstract

[ES] La tecnología CRISPR-Cas9 se ha convertido en una herramienta esencial en la biotecnología de plantas, cambiando nuestra capacidad para manipular genomas y estudiar redes moleculares gracias a las posibilidades ofrecidas tanto por la edición génica como por la regulación. Los recientes avances en la Biología Sintética de plantas, junto con la aparición del sistema CRISPR/Cas, ha acelerado la mejora de cultivos, dando lugar a cultivos con caracteres mejorados, y la obtención de metabolitos novedosos y de valor añadido, mediante procesos de Molecular Farming. A pesar de la alta eficiencia para la mutagénesis especifica de sitio de CRISPR/Cas9 y que los activadores génicos transcripcionales basados en Cas9 (CRISPRa) reclutan efectivamente a la maquinaria transcripcional en células vegetales, existe la necesidad de desarrollar nuevas herramientas para controlar los fenómenos de actividad inespecífica derivados de CRISPR/Cas9. Por tanto, durante la última década, se ha trabajado en la generación de diferentes alternativas, como proteínas Cas9 de alta fidelidad, inhibidores químicos, y más recientemente, proteínas Anti-CRISPR (Acr). La identificación de las proteínas Acr representó un punto de inflexión para el desarrollo de interruptores de regulación en las aplicaciones basadas en CRISPR/Cas. Estas proteínas, derivadas de fagos, fueron reconocidas como inhibidores naturales de los sistemas CRISPR tipo II, incluyendo a Cas9. Sin embargo, a pesar de haberlas descrito en células bacterianas y de mamífero, todavía no han sido caracterizadas en sistemas vegetales. Este estudio brinda la primera descripción de la actividad de AcrIIA4 (una proteína Anti-CRISPR capaz de desarrollar una actividad inhibitoria mayor a otras proteínas Acr) en el sistema vegetal modelo de Molecular Farming, Nicotiana benthamiana. Nuestros resultados demuestran que esta Anti-CRISPR es capaz de inhibir efectivamente la activación y edición génica mediada por CRISPR/Cas9. AcrIIA4 reprime el CRISPRa tanto de genes reporteros como endógenos de una manera altamente eficiente y dosis dependiente. Además, la fusión de un degrón de auxinas a AcrIIA4 permitió generar una regulación inducible por auxinas de genes activados por CRISPRa. La robusta actividad Anti-CRISPR de AcrIIA4 en N. benthamiana reportada en este trabajo hace que sea una herramienta molecular programable esencial para la biotecnología vegetal, ya que otorga un control fuerte y modulable sobre interruptores y circuitos genéticos basados en CRISPR/Cas.

[EN] The CRISPR/Cas technology has become an essential tool in plant biotechnology by changing our capacity for genome manipulation and molecular network study thanks to the possibilities offered by both gene edition and regulation. Recent advances in Plant Synthetic Biology added to the emergence of CRISPR/Cas have accelerated crop breeding, leading to crops with improved traits, the obtention of novel-metabolites and better products derived from Molecular Farming approaches. Despite the high efficiency of CRISPR/Cas9 for site directed mutagenesis and that Cas9-based transcriptional activators (CRISPRa) effectively recruit the transcriptional machinery in plant cells, there is a need for developing new tools for controlling the leakiness and off-target CRISPR-derived phenomena. Thus, during the last decade, there has been a constant work on developing different alternatives, as high-fidelity Cas9 proteins, chemical inhibitors, inducible systems for both Cas9 and gRNAs, and lastly, Anti-CRISPR (Acr) proteins. Identification of Acr proteins represented an inflection point for the development of regulation switches in CRISPR/Cas-based applications. These phage-derived proteins were recognized as natural type II CRISPR/Cas systems inhibitors, including Cas9. However, despite being well described in bacterial and mammalian cells, they have not been characterized in plant systems. The present study brings the first description of the activity of AcrIIA4 (an Anti-CRISPR/Cas9 protein that has been proven to develop a higher inhibitory capacity than other Acr proteins) in the Molecular Farming model plant system Nicotiana benthamiana. Our results demonstrate that this Anti-CRISPR is capable of effectively inhibit both CRISPR/Cas9-mediated gene activation and editing. AcrIIA4 represses CRISPRa of both reporter and endogenous genes in a highly efficient, dose-dependent manner. Moreover, the fusion of an auxin degron to AcrIIA4 allowed the auxin-inducible regulation of CRISPRa activated genes. The robust anti-CRISPR activity of AcrIIA4 in N. benthamiana reported in this work makes it an essential programmable molecular tool for plant biotechnologists as it enables a strong and tunable control over CRISPR/Cas-based genetic switches and circuits.

[CA] La tecnologia CRISPR-Cas9 s'ha convertit en una ferramenta essencial en la biotecnologia de plantes, canviant la nostra capacitat de manipular genomes i estudiar xarxes moleculars gràcies a les possibilitats ofertes tant per l'edició gènica com per la regulació. Els recents avanços en la Biologia Sintètica de plantes, juntament amb l'aparició del sistema CRISPR / Cas, ha accelerat la millora de cultius, donant lloc a cultius amb caràcters millorats, l'obtenció de metabòlits nous i de valor afegit, mitjançant processos de Molecular Farming.Tot i alta eficiència per a la mutagènesi especifica de lloc de CRISPR / Cas9 i que els activadors gènics transcripcionals basats en Cas9 (CRISPRa) recluten efectivament a la maquinària transcripcional en cèl·lules vegetals, hi ha la necessitat de desenvolupar noves eines per controlar els fenòmens d' activitat inespecífica derivats de CRISPR / CAS9. Per tant, durant l'última dècada, s'ha treballat en la generació de diferents alternatives, com proteïnes Cas9 d'alta fidelitat, inhibidors químics, i més recentment, proteïnes Anti-CRISPR (Acr). La identificació de les proteïnes Acr va representar un punt d'inflexió per al desenvolupament d'interruptors de regulació en les aplicacions basades en CRISPR / Cas. Aquestes proteïnes,derivades de fags, van ser reconegudes com a inhibidors naturals dels sistemes CRISPR tipus II, incloent a Cas9. No obstant això, tot i haver-les descrit en cèl·lules bacterianes i de mamífer, encara no han estat caracteritzades en sistemes vegetals.Aquest estudi ofereix la primera descripció de l'activitat d'AcrIIA4 (una proteïna Anti-CRISPR capaç de desenvolupar una activitat inhibitòria major a altres proteïnes Acr) en el sistema vegetal model de Molecular Farming, Nicotiana benthamiana. Els nostres resultats demostren que aquesta Anti-CRISPR és capaç d'inhibir efectivament l'activació i edició gènica mediada per CRISPR / Cas9. AcrIIA4 reprimeix el CRISPRa tant de gens reporters com endògens d'una manera altament eficient i dosi depenent. A més, la fusió d'un degrón de auxines a AcrIIA4 va permetre generar una regulació induïble per auxines de gens activats per CRISPRa. La robusta activitat Anti-CRISPR de AcrIIA4 en N. benthamianareportada en aquest treball fa que sigui una eina molecular programable essencial per a la biotecnología vegetal, ja que atorga un control fort i modulable sobre interruptors i circuits genètics basats en CRISPR / Cas.