Detección y cuantificación de SARS-CoV-2 y su posible correlación con la presencia de crAssphage

Abstract

[ES] El SARS-CoV-2 (del inglés severe acute respiratory síndrome coronavirus 2) es un virus respiratorio causante de la COVID-19. Como ya ocurre con otros virus respiratorios, el SARS-CoV-2 se excreta también en heces lo que nos permite poder detectarlo y cuantificarlo en las aguas residuales con técnicas de biología molecular como la RT-qPCR. Gracias a la detección del ARN de SARS-CoV-2 en aguas residuales podemos utilizar los resultados como una herramienta epidemiológica complementaria a las ya utilizadas a nivel clínico, pudiendo así adelantarnos a la situación que se va a dar en clínica y ejercer una mejor y rápida respuesta sanitaria, previa a la aparición de casos clínicos severos. Por otro lado, el bacteriófago crAssphage se encuentra de forma natural en el tracto gastrointestinal de los seres humanos y, por tanto, se excreta en las heces. Esta característica nos permite utilizarlo como indicador de contaminación fecal vírica en el agua. Se han realizado estudios (Wilder et al. 2021; Haramoto et al. 2018; Polo et al. 2020) los cuales demuestran que esta técnica de co-cuantificación con crAssphage en aguas residuales ayuda a estandarizar los resultados debido al factor de dilución que presentan las muestras de agua residual al mezclarse con agua pluviales. El objetivo del trabajo se centró tanto en la detección y cuantificación de SARS-CoV-2 para observar su dinámica poblacional y su incidencia, como en normalizar los resultados obtenidos con el indicador de contaminación fecal vírica crAssphage en aguas residuales procedentes de colectores de la ciudad de Valencia. Para ello se utilizaron técnicas de biología molecular, como la RT-qPCR para SARS-CoV-2 y la qPCR para crAssphage, para la detección y cuantificación de ambos virus en muestras de colectores de la provincia de Valencia y un control de proceso (PEDV) para evaluar la eficiencia del proceso de concentración y extracción. Los resultados obtenidos se utilizaron para seguir la evolución de SARS-CoV-2 en la provincia de Valencia. En este estudio se analizaron un total de 53 muestras, obtenidas de diferentes colectores de la provincia de Valencia entre el 15 de febrero y el 6 de abril de 2021. Del total de muestras obtenidas, 38 muestras (71,7%) fueron positivas para SARS-CoV-2 con una media de 5,77 ± 1,29 log10 copias genómicas (CG)/L. Los porcentajes de recuperación de PEDV resultaron en un rango de 25-40% con una media de 31,20% ± 20,11%. Los resultados de la concentración del ARN del SARS-CoV-2 en los colectores se compararon con los casos clínicos diagnosticados como positivos en COVID-19 en la provincia de Valencia. Se observó que entre el ratio SARS-CoV-2:crAssphage y N1 no había diferencia a la hora de analizar los datos, por ello se debería hacer un estudio con una mayor cantidad de muestras y su posterior análisis estadístico para, de esta manera, demostrar si hay diferencias significativas. Se ha evidenciado que los casos clínicos fueron descendiendo a lo largo de todo el muestreo tal y como indicaban previamente los resultados de la concentración de ARN de SARS-CoV-2 obtenidos en las muestras. Esta estrategia sería una herramienta muy interesante para aplicarla en efluentes de plantas depuradoras, que pueden utilizarse como agua de riego de cultivos para poder garantizar la seguridad microbiológica de frutas y hortalizas e inclusive para confirmar que el agua de lavado de frutas y verduras es seguro, es decir, que está libre de contaminación fecal tanto bacteriana como vírica.

[EN] Detection and quantification of SARS-CoV-2 and normalization of the results with the indicator of fecal viral contamination crAssphage. SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) is a respiratory virus that causes COVID-19. As with other respiratory viruses, SARS-CoV-2 is also excreted in faeces, which allows us to detect and quantify it in wastewater with molecular biology techniques such as RT-qPCR. Due to the detection of SARS-CoV-2 RNA in wastewater, we can use the results as an epidemiological tool complementary to those already used at the clinical level, thus being able to anticipate the situation that will occur in the clinic and exercise a better and rapid health response, prior to the appearance of severe clinical cases. On the other hand, the bacteriophage crAssphage is found naturally in the gastrointestinal tract of humans and is therefore excreted in faeces. This characteristic allows us to use it as an indicator of viral fecal contamination in water. Studies have been carried out (Wilder et al. 2021; Haramoto et al. 2018; Polo et al. 2020) which show that this co-quantification technique with crAssphage in wastewater helps to standardize the results due to the dilution factor presented by the wastewater samples when mixed with rainwater. The objective of the work focused both on the detection and quantification of SARS-CoV-2 to observe its population dynamics and its incidence, and on normalizing the results obtained with indicator of viral fecal contamination crAssphage in wastewater. For this, molecular biology techniques were used, such as RT-qPCR for SARS-CoV2 and qPCR for crAssphage, for the detection and quantification of both viruses in samples from collectors in the city of Valencia and a process control (PEDV) to monitor the efficiency of the concentration and extraction process. The results obtained were used to follow the evolution of SARS-CoV-2 in the city of Valencia. In this study, a total of 53 samples were analyzed, obtained from different collectors in the city of Valencia between February 15 and April 6, 2021. Of the total samples obtained, 38 samples (71.7%) were positive for SARS-CoV-2 with a mean of 5.77 ± 1.29 log10genome copies (GC)/L. PEDV recovery percentages resulted in a range of 25-40% with an average of 31.20% ± 20.11%. The results of the concentration of SARS-CoV-2 RNA in the collectors were compared with the clinical cases diagnosed as positive for COVID-19 in the city of Valencia. It was observed that between the ratio SARS-CoV-2:crAssphage and N1 there was no difference when analyzing the data, so further studies should be done with a larger number of samples and its subsequent statistical analysis to, in this way, demonstrate if there are significant differences. Overall, it has been shown that the clinical cases were decreasing throughout the entire sampling period as previously indicated by the results obtained in the samples. This strategy would be a very interesting tool to apply in effluents from treatment plants, which can be used as irrigation water for crops to guarantee the microbiological safety of fruits and vegetables and even to confirm that the washing water for fruits and vegetables is safe that is, it is free from both bacterial and viral fecal contamination.