Obtención de soportes biomiméticos para la expansión de células madre mesenquimales

Abstract

[ES] El cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea humanas (bMSC) sobre ciertos soportes puede inducir su diferenciación espontánea hacia uno de sus linajes. El efecto de ciertas proteínas y /o polisacáridos, componentes de la matriz extracelular de la médula ósea, puede tener también un efecto en este sentido. Esta capacidad es muy relevante de cara a ciertas aplicaciones en Ingeniería Tisular. El objetivo de este trabajo ha sido el desarrollo de nuevos soportes planos funcionalizados con biomoléculas relevantes en la composición de la matriz extracelular de la médula ósea, en este caso gelatina y condroitín sulfato, para el futuro análisis tanto de la adhesión como de la proliferación de bMSCs sobre dichos soportes. La funcionalización se ha llevado a cabo mediante el método de layer-by-layer (LbL) en el que se depositan alternativamente capas de polielectrolitos cargados positiva y negativamente, policationes y polianiones, que se unen entre sí mediante interacciones electrostáticas. En particular, se han desarrollado soportes planos de ácido poli-L-láctico funcionalizados que exhiben en la superficie condroitín sulfato, o gelatina, construidos por LbL. En el caso de la gelatina se ha empleado el alginato como contra-ion (Gel/Alg), mientras que en caso del condroitín sulfato se ha empleado el quitosano (CS/Chi) y además se han utilizado gelatina y condroitín sulfato como última combinación (CS/Gel). Tras dicha síntesis, se ha llevado a cabo una caracterización física de dichos soportes funcionalizados para demostrar la presencia de las capas de polielectrolitos depositados. Mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo se ha confirmado la presencia del recubrimiento gracias a la visualización de la topografía característica de la superficie de las capas, y mediante espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier se ha observado la presencia de los picos correspondientes a los grupos funcionales propios de dichas biomoléculas. Se ha analizado el espesor del recubrimiento LbL gracias a microscopia de fuerza atómica, habiéndose observado un aumento de grosor a medida que se aumentaba el número de capas depositadas. Las concentraciones de biomoléculas presentes han sido calculadas mediante ensayos cuantitativos colorimétricos, y se han analizado las mojabilidades de las superficies mediante la medida del ángulo de contacto. Se ha estudiado la proliferación de bMSC mediante ensayos de proliferación, demostrándose que el par CS/Gel estimula en mayor medida la proliferación de las bMSCs. Además del efecto de estas biomoléculas sobre la adhesión temprana de las bMSCs, caracterizando la morfología celular y adhesiones focales mediante inmunotinciones específicas del núcleo, del citoesqueleto de actina y de las adhesiones focales donde está presente la vinculina. Afirmándose una correcta adhesión celular asociada a los soportes Gel/Alg y CS/Gel a través de la existencia de células con una morfología de carácter fibroblástico. Por todo ello, se ha logrado desarrollar soportes funcionalizados con potencial para ser empleados en el campo de la Ingeniería Tisular, en posteriores estudios de diferenciación espontánea de las bMSC.

[EN] The culture of human bone marrow mesenchymal stem cells (bMSC) on certain supports can induce their spontaneous differentiation towards one of their lineages. The effect of certain proteins and/or polysaccharides, components of the extracellular matrix of the bone marrow, may also have an effect in this regard. This capability is very relevant for certain applications in Tissue Engineering. The objective of this work has been the development of new flat supports functionalized with biomolecules relevant in the composition of the extracellular matrix of the bone marrow, in this case gelatin and chondroitin sulphate, for the future analysis of both the adhesion and the proliferation of bMSCs on these supports. The functionalization has been carried out by means of the layer-by-layer method (LbL) in which layers of positively and negatively charged polyelectrolytes, polycations and polyanions are deposited alternately, which are joined together by electrostatic interactions. In particular, flat supports of functionalized poly-L-lactic acid that exhibit on the surface chondroitin sulfate, or gelatin have been developed, built by LbL. In the case of gelatin, alginate has been used as a counter-ion (Gel / Alg), while in the case of chondroitin sulfate, chitosan has been used (CS / Chi) and also gelatin and chondroitin sulfate have been used as the last combination (CS / Gel). After this synthesis, a physical characterization of these functionalized supports has been carried out to demonstrate the presence of the polyelectrolyte¿s layers deposited. By field emission scanning electron microscopy the presence of the coating has been confirmed thanks to the visualization of the characteristic topography of the layers surface, and by means of Fourier transform infrarred spectroscopy, the presence of the peaks corresponding to the functional groups of these biomolecules has been observed. The thickness of the LbL coating has been analyzed thanks to atomic force microscopy, having observed an increase in thickness as the number of layers deposited increased. The concentrations of biomolecules present have been calculated by quantitative colorimetric assays, and the wettability of the surfaces have been analyzed by measuring the contact angle. The proliferation of bMSC has been studied through proliferation assays, demonstrating that the CS /Gel pair stimulates to a greater extent the proliferation of bMSC. In addition, the effect of these biomolecules on the early adhesion of bMSCs has been studied, by characterizing cell morphology and focal adhesions by specific immunostainings of the nucleus, actin cytoskeleton and focal adhesions where vinculin is present. Affirming a correct cell adhesion associated with the supports Gel/Alg and CS/Gel through the existence of cells with a fibroblastic morphology. For all these reasons, it has been possible to develop functionalized supports with the potential to be used in the field of Tissue Engineering, in subsequent studies of spontaneous bMSC differentiation.