Caracterización funcional de los factores de transcripción de la subfamilia NGATHA durante el desarrollo del estilo y estigma en el arroz (Oryza sativa, L.).

Abstract

[ES] El estudio del desarrollo y la evolución del carpelo son cuestiones centrales para la biología vegetal. Se han logrado avances en el esclarecimiento de las redes genéticas que dirigen el de desarrollo del carpelo en Arabidopsis thaliana, mientras se conoce mucho menos en las gramíneas, una familia que incluye cultivos de importancia económica como el arroz (Oryza sativa L.). En esta Trabajo de Fin de Máster se ha pretendido profundizar en el estudio de un pequeño clado de la superfamilia de factores de transcripción tipo B3, los genes NGATHA (NGA), en arroz, además de un análisis de su conservación funcional dentro de las angiospermas. Para ello, se han caracterizado funcionalmente dichos genes mediante el análisis de líneas de pérdida de función de los mismos y su caracterización fenotípica. Así, se ha determinado que el patrón de expresión espacio-temporal de los cuatro genes NGA de arroz (OsNGA1/2/3/4) coinciden con las regiones apicales del gineceo afectadas en los mutantes atnga descritas en Arabidopsis, es decir, el estilo y el estigma. Las flores en mutantes osnga de arroz presentaban estilos y estigmas reducidos y una disminución significativa de la fertilidad, lo que sugiere posibles defectos adicionales en las partes internas del carpelo, por ejemplo, en el tracto de transmisión como sucede en los mutantes atnga. El hecho de que el fenotipo de los mutantes dobles o triples osnga fuera más severo que el de los mutantes simples sugiere que los OsNGA actúan de forma redundante o parcialmente redundante al igual que NGA de Arabidopsis (AtNGA). Por otra parte, se realizaron estudios comparativos de la conservación funcional de las proteínas NGA de arroz, Arabidopsis y Amborella trichopoda mediante su expresión heteróloga en Arabidopsis. Se clonaron OsNGA2 de arroz, AtNGA3 de Arabidopsis (AtNGA3) y los genes NGA y NGA-like de Amborella (AmbNGA y AmbNGAL) bajo el control del promotor específico de AtNGA3 (pAtNGA3) y se expresaron en Arabidopsis para evaluar el grado de complementación del fenotipo de un doble mutante nga1-4 nga3-3. Encontramos que los fenotipos de las líneas transgénicas durante el desarrollo de la hoja y de la flor que expresaban pAtNGA3::OsNGA2 y pAtNGA3::AtNGA3 eran muy similares a los de sobreexpresión reportados para los AtNGA, tanto para el fenotipo del gineceo como para el de las hojas en roseta. Esto sugiere que la región del promotor de AtNGA3 utilizada induce un nivel de expresión más fuerte de lo que se esperaba. Además, a pesar de la distancia evolutiva de arroz y Arabidopsis, las líneas pAtNGA3::OsNGA2 mostraron un rescate de la zona apical del gineceo capaz de reducir o anular los defectos en el estilo y estigma del fondo atnga1-4 atnga3-3. Por el contrario, las líneas que expresaban AmbNGA y AmbNGAL mantenían dichos defectos en la zona apical del gineceo, sugiriendo que las proteínas NGA/NGAL de Amborella no son funcionales en Arabidopsis. Nuestro trabajo sugiere una conservación funcional de los genes NGA muy fuerte entre eudicotiledóneas y monocotiledóneas, que no se extiende a las angiospermas basales.

[EN] The study of the development and evolution of the carpel are central questions for plant biology. Advances have been made in elucidating the genetic networks that drive carpel development in Arabidopsis thaliana, while much less is known in grasses, a family that includes economically important crops such as rice (Oryza sativa L.). In this Master's Thesis, the aim has been to delve into the study of a small clade of the superfamily of transcription factors type B3, the NGATHA (NGA) genes, in rice, in addition to an analysis of their functional conservation within angiosperms. To do this, these genes have been functionally characterized by analyzing their loss of function lines and their phenotypic characterization. Thus, it has been determined that the spatio-temporal expression pattern of the four rice NGA genes (OsNGA1/2/3/4) coincide with the apical regions of the gynoecium affected in the atnga mutants described in Arabidopsis, that is, the style and stigma. Flowers in rice osnga mutants showed reduced styles and stigmas and a significant decrease in fertility, suggesting possible additional defects in the internal parts of the carpel, for example, in the transmission tract as in the atnga mutants. The fact that the phenotype of the osnga double or triple mutants was more severe than that of the single mutants suggests that OsNGA act redundantly or partially redundant like Arabidopsis NGA (AtNGA). On the other hand, comparative studies were carried out on the functional conservation of the NGA proteins from rice, Arabidopsis and Amborella trichopoda through their heterologous expression in Arabidopsis. OsNGA2 from rice, AtNGA3 from Arabidopsis (AtNGA3) and the NGA and NGA-like genes from Amborella (AmbNGA and AmbNGAL) were cloned under the control of the specific AtNGA3 promoter (pAtNGA3) and expressed in Arabidopsis to evaluate the degree of complementation of the phenotype of a double mutant atnga1-4 atnga3-3. We found that the phenotypes of the transgenic lines during the development of the leaf and the flower that expressed pAtNGA3::OsNGA2 and pAtNGA3::AtNGA3 were very similar to those of overexpression reported for the AtNGA, both for the phenotype of the gynoecium and for the rosette leaves. This suggests that the AtNGA3 promoter region used induces a stronger expression level than expected. Furthermore, despite the evolutionary distance of rice and Arabidopsis, the pAtNGA3::OsNGA2 lines showed a rescue of the apical zone of the gynoecium capable of reducing or canceling the defects in the style and stigma of the atnga1-4 atnga3-3 background. On the contrary, the lines expressing AmbNGA and AmbNGAL maintained these defects in the apical zone of the gynoecium, suggesting that the Amborella NGA / NGAL proteins are not functional in Arabidopsis. Our work suggests a very strong functional conservation of NGA genes between eudicots and monocots, which does not extend to basal angiosperms.