Optimization of base editing tools in maize

Abstract

[ES] Las mutaciones puntuales dirigidas a través de técnicas de edición del genoma tienen un gran potencial para desarrollar variedades mejoradas de cultivos, ya que muchos rasgos agronómicos están determinados por polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). La edición de bases es una nueva técnica de edición del genoma que permite la creación de cambios precisos de un solo par de bases de una manera programable. Hay dos tipos de editores de base (BE): los editores de base de citosina (CBE) que realizan conversiones de base de C-a-T y los editores de base de adenina (ABE) que realizan conversiones de base de A-a-G. Recientemente, se han desarrollado CBE para ediciones de base C-a-G o C-a-A para animales y bacterias. En este estudio, desarrollamos CBE para la edición de bases C-a-G / C-a-A en plantas. Para cuantificar la eficiencia de la edición, desarrollamos un sistema de selección de GFP para detectar rápidamente la edición de base en protoplastos de maíz. El sistema emplea un reportero de GFP inactivo que se activa con la conversión de bases de C-a-G o C-a-A. Se probaron siete CBE y seis reporteros GFP, sin embargo, no se observó edición de base de C-a-G o de C-a-A usando los reporteros.

La edición de bases puede variar según el gene diana. Por lo tanto, evaluar los editores de base en genes endógenos puede proporcionar una estimación más precisa de la eficiencia de edición del editor de base en genes que codifican para rasgos específicos en plantas. Probamos trece sitios diana dentro de seis genes de maíz (GRF1, FEA3, SMK1, LG2, DWF4, EMP16) mediante edición de base única y multiplex. Once de los sitios de diana [GRF1, FEA3 (1-1, 1-2), SMK1 (2-1, 2-2), LG2 (3-1, 3-2), DWF4 (4-1, 4-2)], EMP16 (5-1, 5-2)] mostró >10% de edición C-a-T y solo un sitio diana [DWF4 (4-2)] mostró un 9% de edición C-a-G. Nuestros resultados sugieren que nuestros BE tienen una baja actividad de edición C-a-G / C-a-A y que utilizar genes endógenos para cuantificar este tipo de ediciones puede ser una mejor estrategia que utilizar un sistema reportero fluorescente.

[EN] Targeted point mutations via genome editing techniques have great potential for developing improved crop varieties as many important agronomic traits are determined by single nucleotide polymorphisms (SNPs). Base editing is a new genome-editing technique that enables the creation of precise single base-pair changes in a programmable manner. There are two types of base editors (BEs): Cytosine Base editors (CBEs) that make C-to-T base conversions and Adenine Base Editors (ABEs) that make A-to-G base conversions. Recently, CBEs for C-to-non-T base edits have been developed for mammalian and bacterial systems. In this study, we developed CBEs for C-to-G/C-to-A base editing in plant systems. To quantify editing efficiency, we developed a GFP screening system to quickly detect base editing in maize protoplasts. The system employs an inactive GFP reporter that is activated upon C-to-G or C-to-A base editing. Seven CBEs and Six GFP reporters were tested, however, no C-to-G or C-to-A base editing was observed using the reporter systems.

Base editing activity can vary depending on the target site. Thus, testing base editors on endogenous targets can give a more accurate estimation of base editor editing efficiency on specific traits in plants. Here, we tested thirteen target sites within six maize genes (GRF1, FEA3, SMK1, LG2, DWF4, EMP16) by single and multiplex base editing. Eleven of the target sites [GRF1, FEA3 (1-1, 1-2), SMK1(2-1, 2-2), LG2 (3-1, 3-2), DWF4 (4-1, 4-2), EMP16 (5-1, 5-2)] showed >10% of C-to-T base editing and only one target site [DWF4 (4-2)] showed a 9% of C-to-G base editing. Our results suggest that our BEs have low C-to-G/C-to-A editing activity and that endogenous targets can be a better approach than a fluorescent reporter system to quantify C-to-G or C-to-A editing outcomes.