Producción en plantas de nanopartículas recombinantes derivadas del virus del grabado del tabaco

Abstract

[ES] El uso biotecnológico de nanopartículas virales (VNPs) suscita un gran interés debido a sus potenciales aplicaciones biotecnológicas en campos como la medicina o la nanotecnología. Las VNPs permiten la presentación de epítopes de interés fusionados a las proteínas de cubierta (CP) virales. En este trabajo se describe la generación de nanopartículas virales recombinantes derivadas del virus del grabado del tabaco (TEV) en plantas de Nicotiana benthamiana. Por un lado, hemos producido VNPs genéticamente modificadas capaces de presentar en su superficie la proteína fluorescente verde (GFP) o la roja mCherry. De forma similar a lo reportado para otros virus, la inserción de la secuencia de escape ribosomal F2A derivada de picornavirus fue necesaria para generar una población mixta de CPs decoradas y sin modificar que permitan el correcto ensamblaje de la particula viral. Por otro lado, hemos comenzado con el desarrollo de VNPs híbridas capaces de exponer en su superficie dos proteínas distintas. Para ello generamos un sistema de coinfección de TEV junto a un vector viral derivado del virus X de la patata (PVX), capaz de producir una segunda CP de TEV en trans. La capacidad infectiva de los clones virales recombinantes y la presencia de las proteínas de interés en la progenie viral fue analizada por ensayos de RT-PCR y de Western-blot, así como por microscopía de fluorescencia. Finalmente, con el objetivo de en un próximo paso analizar el correcto ensamblaje de las VNPs recombinantes generadas, optimizamos un protocolo eficiente de purificación de partículas virales de TEV, las cuales pudieron ser observadas por microscopía electrónica de transmisión. Estas VNPs recombinantes presentando una o más proteínas de interés sobre su superficie constituyen una novedosa herramienta biotecnológica con potenciales aplicaciones en la medicina, tales como su uso como vacunas, biosensores o en marcaje celular.

[EN] The biotechnological use of viral nanoparticles (VNP) arouses great interest due to their potencial biotechnological applications in fields such as medicine or nanotechnology. VNPs allow the presentation of epitopes of interest fused to viral coat proteins (CP). In this work, the generation of recombinant viral nanoparticles derived from tobacco etch virus (TEV) in Nicotiana benthamiana plants is described. On the one hand, we have produced genetically modified VNPs capable of presenting green fluorescent protein (GFP) or red fluorescent protein (mCherry) on their surface. Acording to previous reports in other virus, insertion of the F2A ribosomal escape sequence derived from picornavirus was necessary to generate a mixed population of decorated and unmodified CPs that allowed the correct assembly of the viral particles. On the other hand, we have started the development of hybrid VNPs capable of exposing two different proteins on their surface. To do this, we generated a coinfectation system based on TEV together with a viral vector derived from potato virus X (PVX), capable of producing a second TEV CP in trans. The infective capacity of the recombinant viral clones and the presence of the interest proteins in the viral progeny were analyzed by RT-PCR and Western-blot assays, as well as by fluorescence microscopy. Finally, whit the aim of analyzing the correct assembly of the generated recombinant VNPs in a next step, we optimize an efficient protocol for the purification of TEV viral particles, which can be observed by transmission electron microscopy. These recombinant VNPs presenting one or more proteins of interest on their surface, are a novel biotechnological tool with potential applications in medicine, such as their use as vaccines, biosensors, or cell imaging.