Clonación y caracterización funcional de la proteína ClpB de distintos microorganismos residentes en la microbiota humana.

Abstract

[ES] La microbiota humana se define como el conjunto de microorganismos que habitan en nuestro cuerpo de manera simbiótica, sin causar daño en él; principalmente, en lugares como la piel, la cavidad oral y el tracto gastrointestinal. Estos organismos, entre los que se incluyen bacterias, arqueas, hongos y virus forman un ecosistema complejo y dinámico que se encuentra en constante evolución, siendo completamente distinto en diferentes puntos vitales como la infancia o la vida adulta. En particular, los microorganismos que componen nuestra microbiota intestinal realizan funciones esenciales implicadas en la salud humana, entre ellas destacan: su influencia en la digestión de alimentos, la producción de vitaminas, la protección contra patógenos o incluso su estrecha y recién conocida relación con el sistema nervioso. Sin embargo, esta intrincada situación de equilibrio puede romperse, y es entonces cuando pueden surgir una serie de problemas de salud. Factores como el consumo excesivo de alimentos ultra-procesados ricos en azúcares refinados y grasas saturadas, problemas de sueño, intolerancias alimentarias o enfermedades inmunitarias pueden causar un desequilibrio de la mal llamada flora intestinal. Esto puede conllevar a una reducción tanto en la diversidad como en la cantidad de microorganismos comensales, lo que puede derivar en patologías como la enfermedad inflamatoria intestinal, cáncer, diabetes de tipo 2, enfermedades cardiovasculares, obesidad e incluso enfermedades mentales como la depresión. La proteína caseinolítica proteasa B o ClpB, es una chaperona que se encuentra en las células de todo el organismo, siendo más abundante en el cerebro. Su función es la de desplegar las proteínas mal plegadas que pudieran formar aglomeraciones, y, alteraciones en esta proteína pueden desembocar en patologías metabólicas y/o intestinales. Diversos estudios, muestran que la microbiota intestinal también produce homólogos funcionales de esta proteína (por ejemplo, Escherichia coli) y que está implicada en la regulación de la saciedad, al poseer una pequeña región estructural similar a la hormona estimulante de melanocitos o ¿-MSH, lo cual la convierte en un potencial mimético de dicha función. De hecho, un estudio reciente expone que la bacteria Hafnia alvei, simbionte de tracto gastrointestinal, y en concreto su proteína ClpB, podría utilizarse como aproximación terapéutica para ayudar a los individuos obesos a adelgazar. En el presente Trabajo de Fin de Máster (TFM) se ha planteado la clonación y sobre-expresión controlada de la proteína ClpB codificada en el genoma de la bacteria Bacteroides uniformis CECT 7771, una cepa con potencial probiótico capaz de reducir el aumento del peso corporal, así como los niveles plasmáticos de colesterol, triglicéridos, glucosa y leptina en ratones obesos. La investigación realizada en el laboratorio Host-Interactions in Metabolic Health del Centro de investigación Príncipe Felipe (CIPF), donde se realizó el presente TFM, sugiere que dicho microorganismo es, además, capaz de modular la microbiota intestinal y las alteraciones inmunitarias asociadas a la obesidad de acuerdo con los últimos resultados de sus investigaciones. Por consiguiente, el objetivo de este estudio es clonar y purificar la proteína ClpB presente en Bacteroides uniformis. Para ello, se utilizarán técnicas de biología molecular, bioquímicas y biotecnológicas con la finalidad última de indagar si el mecanismo por el cual esta bacteria modula positivamente la saciedad en el hospedador se debe a la presencia de ClpB, que mimetizaría la actividad de la ¿-MSH humana. De esta forma, se podrá en el futuro caracterizar y entender en profundidad dicho mecanismo molecular para validar el uso de esta cepa como una herramienta capaz de solventar el problema mundial que supone la obesidad.

[EN] The human microbiota is defined as the set of microorganisms that inhabit our body in a symbiotic way, without causing harm to it, mainly in places such as the skin, oral cavity and gastrointestinal tract. These organisms, which include bacteria, archaea, fungi and viruses, form a complex and dynamic ecosystem that is in constant evolution, being completely different at different vital points such as infancy or adulthood. In particular, the microorganisms that make up our intestinal microbiota perform essential functions involved in human health, among them: their influence on food digestion, vitamin production, protection against pathogens or even their close and recently known relationship with the nervous system. However, this intricate balance can be disrupted, and it is then that a number of health problems can arise. Factors such as excessive consumption of ultra-processed foods rich in refined sugars and saturated fats, sleep problems, food intolerances or immune diseases can cause an imbalance of the poorly named intestinal flora. This can lead to a reduction in both the diversity and quantity of commensal microorganisms, which can lead to pathologies such as inflammatory bowel disease, cancer, type 2 diabetes, cardiovascular disease, obesity and even mental illnesses such as depression. Caseinolytic protein protease B, or ClpB, is a chaperone found in cells throughout the body, but is most abundant in the brain. Its function is to unfold misfolded proteins that could form clumps, and alterations in this protein can lead to metabolic and/or intestinal pathologies. Several studies show that the intestinal microbiota also produce functional homologues of this protein (e.g., Escherichia coli) and that it is involved in the regulation of satiety, possessing a small structural region similar to melanocyte-stimulating hormone or ¿-MSH, which makes it a potential mimetic of this function. In fact, a recent study shows that the bacterium Hafnia alvei, a symbiont of the gastrointestinal tract, and specifically its ClpB protein, could be used as a therapeutic approach to help obese individuals lose weight. In the present Master's Thesis (TFM), the cloning and controlled overexpression of the ClpB protein encoded in the genome of the bacterium Bacteroides uniformis CECT 7771, a strain with probiotic potential capable of reducing body weight gain, as well as plasma levels of cholesterol, triglycerides, glucose and leptin in obese mice, has been proposed. The research carried out in the Host-Interactions in Metabolic Health laboratory of the ¿Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF)¿, where the present TFM was performed, suggests that this microorganism is also capable of modulating the intestinal microbiota and the immune alterations associated with obesity according to the latest results of their research. Therefore, the aim of this study is to clone and purify the ClpB protein present in Bacteroides uniformis. For this purpose, molecular biology, biochemical and biotechnological techniques will be used with the ultimate aim of investigating whether the mechanism by which this bacterium positively modulates satiety in the host is due to the presence of ClpB, which mimics the activity of human ¿-MSH. In this way, it will be possible in the future to characterize and understand this molecular mechanism in depth in order to validate the use of this strain as a tool capable of solving the global problem of obesity.