Estudio del papel del factor de transcripción LAG-1 en el proceso de diferenciación terminal de las neuronas serotonérgicas ADF en C. elegans

Abstract

[ES] Las neuronas que sintetizan el neurotransmisor serotonina se denominan neuronas serotonérgicas. La serotonina tiene funciones esenciales en el organismo como la regulación del sueño, el apetito o el estado de ánimo. Debido a su función clave, alteraciones en el sistema serotonérgico se relacionan con enfermedades psíquicas tan importantes como la depresión, el trastorno bipolar, la esquizofrenia o el autismo. Para comprender las bases genéticas de estas enfermedades, el estudio de cómo se genera una neurona serotonérgica madura funcional es esencial. A nivel molecular, las neuronas serotonérgicas maduras de cualquier organismo se caracterizan por la expresión coordinada de una batería de genes filogenéticamente conservados, conocidos como genes de la vía de la serotonina. Estos genes codifican para enzimas y transportadores implicados en la síntesis, liberación y recaptación del neurotransmisor serotonina. Los genes de la vía de la serotonina confieren a las neuronas serotonérgicas su identidad, por lo que conocer cómo se activa su expresión durante el desarrollo nos ayudará a comprender los mecanismos implicados en el proceso de diferenciación de las mismas. Dado que estos genes se encuentran conservados filogenéticamente, este trabajo propone el uso del modelo C. elegans para su estudio. El sistema serotonérgico de este nematodo está formado por 3 subtipos neuronales (NSM, ADF y HSN), diferentes anatómica y funcionalmente. En el presente trabajo, nos hemos centrado en el estudio de la diferenciación terminal de la neurona neurosecretora ADF. Previamente al inicio del trabajo, mediante estudios in vivo en C. elegans realizados en el laboratorio, se determinaron las regiones reguladoras mínimas involucradas en la activación transcripcional de los genes de la vía de la serotonina (tph-1, cat-1, cat-4, bas-1 y mod-5) en las neuronas ADF, y tras realizar análisis bioinformáticos, experimentos preliminares de mutagénesis dirigida y ARN de interferencia, los datos sugirieron que proteínas de la familia CSL (CBF1 en humanos, Su(H) en Drosophila melanogaster y LAG-1 en C. elegans) y el factor HLH-14 podrían estar implicados en la activación de los genes de la vía de la serotonina en las neuronas ADF. El objetivo principal de este trabajo ha sido el analizar el papel de LAG-1 y de su posible cofactor HLH- 14 en la regulación directa de los genes de la vía de la serotonina en las neuronas ADF en C. elegans. Con este fin, en primer lugar, se confirmó la expresión del factor de transcripción LAG-1 en la neurona ADF mediante el empleo de una cepa reportera para el gen. En segundo lugar, para demostrar la regulación directa de los genes de la vía de la serotonina a través de LAG-1 y/o miembros de la familia HLH, se generaron cepas reporteras de las secuencias reguladoras de los genes de la vía de la serotonina portando mutaciones puntuales en los sitios de unión CSL (LAG-1) y E-box (sitios de unión para los factores HLH). Finalmente, se analizó la expresión de los genes de la vía de la serotonina en cepas mutantes para el gen lag-1. Los resultados obtenidos en los distintos experimentos sugieren que LAG-1 y su posible cofactor HLH-14 son necesarios en la activación de los genes de la vía de la serotonina en ADF y en consecuencia, en el proceso de diferenciación de la neuronas ADF en C. elegans. Palabras

[EN] Neurons that synthesize the serotonin neurotransmitter are known as serotonergic neurons. Serotonin has essential functions such as regulation of sleep, apetite or mood. Due to its key functions, deregulation of serotonin signaling might underlie psychiatric disorders such as depression, bipolar disorder, schizophrenia or autism. Serotonergic neurons from any organism are characterized by the coordinated expression of a battery of phylogenetically conserved genes, known as serotonergic pathway genes. These genes code for enzymes and transporters that are involved in the synthesis, release, recycling and degradation of the serotonin neurotransmitter. The serotonin pathway genes define the serotonergic neuron’s identity. Thus, knowing how the expression of these genes is activated during development will help understand the mechanisms involved in the differentiation of these neurons. Thanks to the phylogenetic conservation of these genes, we propose to use the simple organism C. elegans for the study. The serotonergic system of this nematode is composed of three neuron subtypes (NSM, HSN, ADF), which are anatomically and functionally different. In this project, we have studied the differentiation process of the neurosecretory neurons ADF. Before the beginning of this project, in vivo studies in C. elegans allowed to identify the minimal regulatory regions that activated the expression of the serotonin pathway genes (tph-1, bas-1, cat-1, cat-4 and mod-5) in the ADF neurons and after performing bioinformatics analysis, directed mutagenesis and interference RNA experiments, the results suggested that proteins from the CSL family ((CBF1 in humans, Su(H) in Drosophila melanogaster y LAG-1 in C. elegans) and the HLH-14 factor could be involved in the activation of the serotonin pathway genes in the ADF neurons. The main objective of this project was to analyze the role of LAG- 1 and its possible co-factor HLH-14 in the direct regulation of the serotonin pathway genes in the ADF neurons in C. elegans. With this aim, firstly, LAG-1 expression in the ADF neurons was analyzed using a reporter of the gene. Secondly, to demonstrate the direct regulation of the serotonin pathway genes by LAG-1 and/or factors from the HLH family, we generated reporters including point mutations in CSL sites and E-boxes (binding sites for HLH factors) in the minimal regulatory regions of the serotonin pathway genes for the ADF neuron. Finally, the expression of the serotonin pathway genes was analyzed in mutants for the lag-1 gene. The results obtained in the different experiments suggest that LAG-1 and its cofactor HLH-14 are required for the activation of the serotonin pathway genes in ADF and in consequence, in the terminal differentiation of this neuron in C. elegans.