Modelos de toxicidad por péptidos RAN con polialaninas y poliserinas en Caenorhabditis elegans

Abstract

[ES] La enfermedad de Huntington (EH) es una patología neurodegenerativa de herencia autosómica dominante y de baja prevalencia. Se encuentra dentro de los desórdenes causados por expansiones de tripletes CAG. En el exón 1 del gen de la huntingtina (htt) se encuentra una secuencia repetitiva de tripletes CAG, que cuando es anormalmente larga (36 o más repeticiones), produce una proteína, llamada huntingtina (Htt) con una ganancia tóxica de función. La Htt mutante (mHtt) tiene tendencia a plegarse mal, y tiende a agregarse, produciendo al final cuerpos de inclusión en la célula. Además de la mHtt, el gen htt produce otros productos tóxicos. Por ejemplo, el ARN que porta estas repeticiones CAG es tóxico por sí mismo. Además, se sabe que se producen péptidos raros que a partir de una traducción no convencional independiente de ATG, lo cual se ha denominado RAN translation (del inglés Repeat-associated non-ATG translation (RAN translation)). Al producirse de forma independiente de ATG, la traducción de este ARNm ocurre en las 3 pautas de lectura. Nuestro objetivo es generar un modelo de gusanos C. elegans que exprese alguna de estos péptidos raros, para comprobar si existe toxicidad, y poder investigar el mecanismo de esta y quizás, en el futuro encontrar sustancias que la eliminen. Para ello, primero, se construyeron varios vectores de expresión para modelizar la toxicidad debida a los péptidos de poliserinas y polialaninas. Las construcciones de ADN se obtuvieron por diferentes técnicas de biología molecular y empleando recombinación homóloga, mediante el sistema de clonación Gateway. Finalmente, se consiguió generar una construcción que codificaba 158 polialaninas. Con esta construcción, se generaron animales transgénicos mediante microinyección, que expresaban este péptido con las repeticiones de polialaninas en todo el sistema nervioso. Se verificó la expresión del transgén a nivel de mensajero (qPCR) y se intentó hacerlo a nivel de proteína (Western Blot). Por último, se confirmó mediante un ensayo de comportamiento del gusano que la expresión de la construcción con las polialaninas es toxica para el nematodo C. elegans.

[EN] Huntington's disease (HD) is a neurodegenerative pathology with autosomal dominant inheritance and low prevalence. It is included within the disorders caused by CAG triplet expansions. In exon 1 of the huntingtin (htt) gene is a repetitive sequence of CAG triplets, which when abnormally long (36 or more repetitions) produces a protein called huntingtin (Htt) with a gain of toxic function. The mutant Htt (mHtt) has a tendency to aggregate, eventually producing inclusion bodies in the cell. In addition, the htt gene generates other toxic products. For example, the RNA carrying these CAG repeats is toxic by itself. Moreover, it is known that rare peptides are produced that from a non-standard translation independent of ATG, Repeat-associated non-ATG (RAN) translation. When produced independently of ATG, the translation of this mRNA occurs in all 3 reading patterns. The objective is to generate a model of C. elegans worms that express some of these rare peptides, to verify toxicity, and to be able to investigate the mechanism of this test, in the future we will find substances that eliminate. For this, first, several expression vectors were constructed to model the toxicity due to peptides of polyserines and polyalanines. DNA constructs were obtained by different molecular biology techniques and using homologous recombination using the Gateway cloning system. Finally, it was possible to generate a construct encoding 158 polyalanines. With this construction, the transgenic animals were generated by microinjection, which is expressed with peptide with repeats of polyalanines throughout the nervous system. The expression of the messenger level (qPCR) was checked and an attempt was made to make a protein level (Western blot). Finally, it was confirmed by a test of behavior of worms that the expression of the construct with the polyamines is toxic for the nematode C. elegans.