Genetic Structure of Diploid Gametes for the Production of Triploid Citrus Hybrids

Abstract

This thesis aimed to study three main aspects: (i) the mechanisms underlying unreduced pollen gamete formation in the diploid `CSO¿ tangor hybrid used as male parent in 4x x 2x triploid breeding programs, (ii) the frequencies and mechanisms involved in the unreduced 2n female gametes production for `Eureka Frost¿ and `Fino¿ lemon genotypes, and (iii) the interspecific recombination and the resulting diploid gamete structures of doubled-diploid `Mexican¿ lime to evaluate the possibility that natural interploid hybridization maybe the origin of C. latifolia (`Tahiti¿ lime type) and C. aurantifolia (`Tanepao¿ lime type) triploid varieties.

The production of 54 tetraploid hybrids from 4x x 2x sexual hybridizations allowed the analysis of the mechanisms underlying unreduced pollen gamete formation. SSR and SNP molecular markers revealed that the majority of these plants were obtained from 2n pollen of the diploid tangor parent. Then, the maximum-likelihood method based on parental heterozygosity restitution (PHR) of centromeric loci revealed that both FDR (First Division Restitution ) with predominant occurrence and to a lower extend SDR (Second Division Restitution) were the mechanisms leading to unreduced male gamete formation in the tangor studied. These observations were confirmed by the analysis of PHR pattern along the linkage group (LG) 2. To our knowledge, this is the first report of tetraploid citrus progenies arising from unreduced pollen and the first description of the coexistence of two meiotic restitution mechanisms (SDR and FDR) producing unreduced pollen in citrus.

In order to study the frequencies and the mechanisms involved in the unreduced 2n female gametes production in two different genotypes of lemon, we produced 43 triploid and tetraploid hybrids from 2x x 2x and 2x x 4x sexual hybridizations using `Eureka Frost¿ and `Fino¿ as female parents. The frequencies of 2n gamete production were respectively 4.9% and 8.3%. The maximum-likelihood analysis and pattern of PHR along LG1 revealed that SDR is the main mechanism of unreduced female lemon gametes (88%), followed by FDR or pre-meiotic doubling (PRD) (7%) and post-meiotic genome doubling (PMD) mechanisms (5%). This is the first report of the production of a large number of lemon progenies from 2n gametes and the first identification of a new mechanism, PMD that has never been observed in citrus and has rarely been described in other herbaceous or woody species.

Across both studies, we demonstrated at the methodological level the effectiveness of using two complementary approaches, the analysis of the PHR pattern in one LG and the maximum-likelihood method based on centromeric loci for distinguishing between the different mechanisms of unreduced gamete production.

We analyzed the meiotic mechanisms of a doubled diploid `Mexican¿ lime, the interspecific recombination and the resulting diploid gamete structures combining a segregation analysis of SSR and SNPs markers, a cytogenetic study and pollen viability evaluation. We concluded that the doubled-diploid `Mexican¿ lime had a predominantly disomic segregation for three LGs, intermediate inheritance with disomic tendency was found for five LGs and intermediate models for one LG. The resulting interspecific diploid gamete structures displayed high C. medica / C. micrantha heterozygosity. The revealed genetic structures of the diploid gametes produced by the doubled-diploid `Mexican¿ lime are compatible with the hypothesis that `Tahiti¿ and `Tanepao¿ triploid varieties results from interploid hybridization involving a doubled-diploid `Mexican¿ like lime. This disomic tendency limits the recombination and the diversity of the diploid gamete population; however the observed pollen viability restoration at tetraploid level could be advantageous for intensive breeding projects.

Esta tesis estudia tres aspectos principales: (i) los mecanismos de la formación de gametos 2n de polen originados por un híbrido diploide (tangor `CSO¿) utilizado como parental masculino en hibridaciones sexuales 4x x 2x, (ii) las frecuencias y los mecanismos de la producción de gametos 2n femeninos en dos genotipos de limón, `Eureka Frost¿ y `Fino¿, y (iii) el análisis de la recombinación interespecífica y las estructuras de los gametos diploides originados por la lima `Mejicana¿ doble diploide para evaluar el origen de las las variedades triploides de lima C. latifolia (`Tahiti¿) y C. aurantifolia (`Tanepao¿). La obtención de 54 híbridos tetraploides a partir de hibridaciones 4x x 2x permitió analizar los mecanismos de la formación de gametos 2n de polen. El análisis molecular reveló que la mayoría de estas plantas se obtuvieron a partir de gametos 2n de polen del parental `CSO¿. A continuación, el análisis mediante el método de máxima verosimilitud indicó que FDR (Restitución de la Primera División meiótica) y SDR (Restitución de la Segunda División meiótica) son los mecanismos implicados con una mayor dominancia de FDR respecto SDR. Estos resultados se confirmaron mediante el análisis de la restitución de la heterocigosidad en el grupo de ligamiento (LG) 2. Con los datos publicados hasta la fecha, es la primera vez que se han obtenido progenies tetraploides de cítricos mediante gametos 2n de polen y es la primera descripción en cítricos de la coexistencia de dos mecanismos SDR y FDR. Para estudiar las frecuencias y los mecanismos de la producción de gametos 2n en dos genotipos de limón, se obtuvieron 43 híbridos triploides y tetraploides a partir de hibridaciones sexuales 2x x 2x y 2x x 4x utilizando los limones `Eureka Frost¿ y `Fino¿ como parentales femeninos. Las frecuencias de producción de gametos 2n fueron respectivamente 4,9% y 8,3%. El análisis de máxima verosimilitud y el patrón de PHR a lo largo del LG1 reveló que SDR es el mecanismo principal de formación de gametos 2n femeninos (88%), seguido por FDR o duplicación del genoma pre-meiosis (PRD) (7%) y se identificó un nuevo mecanismo originado a partir de la duplicación del genoma post-meiosis (PMD) (5%). En este trabajo se describe por primera vez en cítricos la producción de un elevado número de híbridos de limón a partir de gametos 2n y es la primera vez que se identifica un nuevo mecanismo PMD que nunca se ha observado en cítricos. En ambos estudios se demostró la efectividad del uso de dos métodos complementarios, el análisis del patrón de PHR a lo largo de un LG y el método de máxima verosimilitud para distinguir entre los diferentes mecanismos implicados en la formación de gametos 2n. También se ha analizado el modelo de segregación cromosómica de la lima `Mejicana¿ doble diploide (DD) así como la recombinación interespecífica y las estructuras de los gametos diploides resultantes. Se ha realizado análisis de la viabilidad del polen junto con un análisis citogenético y con marcadores SSRs y SNPs. Estos trabajos nos han permitido concluir que la lima `Mejicana¿ DD presenta una segregación predominantemente disómica para tres LGs, herencia intermedia con tendencia disómica para cinco LGs y un tipo de segregación intermedia para un LG. Las estructuras de los gametos diploides mostraron una alta heterocigosis en C. medica/C. micrantha, parentales de la lima `Mejicana¿.

Las estructuras genéticas de los gametos diploides de la lima `Mejicana¿ DD son compatibles con la hipótesis de que las variedades triploides `Tahiti¿ y `Tanepao¿ se obtuvieran a partir de una hibridación interploide a partir de la lima `Mejicana¿ DD. El tipo de segregación disómico conlleva una limitación de la recombinación y la diversidad genética de la población de gametos 2n. Sin embargo la viabilidad del polen de la lima `Mejicana¿ DD en comparación con la lima `Mejicana¿ diploide permite

Aquesta tesi ha tingut com a objectius l'estudi de (i) els mecanismes subjacents a la formació de pol·len de gàmetes 2n al tangor híbrid diploide `CSO', utilitzat com a progenitor masculí en els programes de millora de triploides 4x x 2x (ii) les freqüències i els mecanismes implicats en la producció gàmetes 2n en la femella als genotips de llimona `Eureka Frost¿ i Fina' (iii) la recombinació interespecífica i les estructures resultants de gàmetes diploides del doble-diploide (DD) de `llima Mèxicana' per avaluar la possibilitat que la hibridació interploid natural potser l'origen de les varietats triploides C. latifolia (llima tipus `Tahiti') i C. aurantifolia (llima tipus `Tanepao'). La producció de 54 híbrids tetraploides obtinguts d¿hibridacions sexuals 4x x 2x va permetre l'anàlisi dels mecanismes de formació de gàmetes 2n de pol·len. Els marcadors moleculars SSR i SNP van revelar que la majoria d'aquestes plantes es van obtenir de pol·len 2n del parental diploide tangor. Llavors, el mètode de màxima probabilitat va revelar que tant FDR (Restitució en la Primera Divisió), amb ocurrència predominant, com SDR (Restitució en la Segona Divisió) van ser els mecanismes que condueixen a la formació de gàmetes masculins 2n en aquest tangor. Aquestes observacions van ser confirmades per l'anàlisi de patró de RHP al llarg del cromosoma 2. Des del nostre coneixement, aquest és el primer estudi de progènies de cítrics tetraploides derivats de pol·len no reduït i la primera descripció de la coexistència de dos mecanismes de restitució meiòtiques (FDR i SDR) produint pol·len no reduït en els cítrics. Per tal d'estudiar les freqüències i els mecanismes implicats en la producció de gàmetes 2n sense reduir de la femella, en dos genotips diferents de llimona, vam obtenir 43 híbrids triploides i tetraploides d¿hibridacions sexuals 2x x 2x i 4x x 2x utilitzant `Eureka Frost ' i `Fino' com progenitors femenins. Les freqüències de la producció de gàmetes 2n van ser, respectivament, 4,9% i 8,3%. L'anàlisi de màxima probabilitat i el patró de RHP al llarg del cromosoma 1 van revelar que SDR és el principal mecanisme de gàmetes 2n en la llimona utilitzada com parent femení (88%), seguit pels mecanismes FDR o duplicació pre-meiòtica (PRD) (7%) i la duplicació del genoma post-meiòtica (PMD) (5%). Per primera volta en els cítrics s¿ha obtingut un gran nombre de progènie de llimona a partir de gàmetes 2n i s¿ha identificat un nou mecanisme, el PMD que poques vegades s'ha descrit en altres espècies herbàcies o llenyoses. A través dels dos treballs, hem demostrat, a nivell metodològic, l'eficàcia d'utilitzar dos enfocaments complementaris, és a dir, l'anàlisi del patró de RHP en un cromosoma amb el mètode de màxima probabilitat basat en loci centromèrics per distingir entre els diferents mecanismes de la producció de gàmetes 2n . Es van analitzar els mecanismes meiòtics d'un DD `llima Mèxicana', la recombinació interespecífica i les estructures resultants de gàmetes diploides combinant una anàlisi de segregació de marcadors SSR i SNP, un estudi citogenètic i l'avaluació de la viabilitat del pol·len. Hem arribat a la conclusió que el DD de `llima Mèxicana' tenia una segregació predominantment disómica en tres cromosomes, herència intermèdia amb tendència disómica en cinc cromosomes i els models intermedis per a un altre. Les estructures resultants de gàmetes diploides interespecífiques mostren alta heterozigositat C. medica / C. micrantha. Les estructures genètiques revelades dels gàmetes diploides produïts pel DD de `llima Mèxicana' són compatibles amb la hipòtesi que les varietats triploides `Tahiti¿ i `Tanepao¿ resulten de la hibridació interploide que impliquen un DD de tipus `llima Mèxicana'. Aquesta tendència disómica limita la recombinació i la diversitat de la població de gàmetes diploides, però, la restauració de la viabilitat