Platynereis Dumerilii as a Model of Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Biosynthesis in Polychaetes

[ES] Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA, ≥ C20), como el ácido araquidónico (ARA), el ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido docosahexaenoico (DHA), son nutrientes esenciales en numerosos procesos biológicos animales y proporcionan beneficios para la salud humana, en particular los LC-PUFA n-3 (EPA y DHA). La reducción de su contenido en productos de acuicultura, consecuencia del uso creciente de ingredientes no marinos en los piensos, ha impulsado la búsqueda de fuentes alternativas. Los invertebrados acuáticos destacan como candidatos prometedores, ya que varias líneas evolutivas son capaces de biosintetizar de novo PUFA y LC-PUFA. Entre ellos, el poliqueto Platynereis dumerilii ha emergido como modelo idóneo, al contar con enzimas desaturasas de tipo methyl-end. El objetivo general de esta tesis fue comprender los mecanismos de biosíntesis de LC-PUFA en poliquetos, con especial atención a P. dumerilii. Para ello se abordaron cuatro objetivos específicos: (1) caracterizar el repertorio, las funciones enzimáticas y la evolución de las desaturasas front-end; (2) analizar las elongasas (Elovl) implicadas en la síntesis de LC-PUFA; (3) desarrollar estrategias de disrupción génica mediante CRISPR-Cas9 y evaluar la inhibición química de desaturasas; y (4) estudiar los efectos de la temperatura sobre la composición de ácidos grasos y el lipidoma polar.

Los resultados muestran que P. dumerilii posee la capacidad completa para la biosíntesis de novo de ARA y EPA, pero no de DHA. Se identificaron tres desaturasas front-end (Fed1, Fed2 y Fed3), de las cuales Fed1 (actividad Δ5) y Fed2 (actividad Δ6 y Δ8) cubren todas las reacciones necesarias para la síntesis de LC-PUFA a partir de precursores C18. Además, se caracterizaron cuatro elongasas (Elovl2/5, dos genes Elovl4 y Elovl1/7), con patrones de expresión y afinidades de sustrato complementarias. Entre ellas destaca una Elovl4 de longitud inusualmente grande, con un dominio KH único en animales y expresión en fotorreceptores, lo que sugiere un papel en la visión. Mediante un sistema de expresión heteróloga en levaduras se validó la actividad de las enzimas, aunque con limitaciones para inferir sus funciones in vivo. Por ello, se diseñaron sgRNA para seis genes clave de la biosíntesis de LC-PUFA. Los ensayos de microinyección revelaron una alta eficiencia mutagénica de elovl2/5 en larvas, pero no se obtuvieron mutantes viables en estadios juveniles, lo que sugiere la importancia esencial de esta enzima. Como aproximación alternativa, se evaluó el inhibidor CP-24879, que redujo significativamente la actividad de tres desaturasas, si bien su baja especificidad limita su uso en estudios funcionales dirigidos.

En relación con la respuesta a la temperatura, se observaron cambios significativos en la composición de ácidos grasos y de lípidos polares. A 25 °C aumentaron los ácidos grasos saturados y los LC-PUFA n-6, mientras que a 15 °C se incrementaron lisofosfolípidos, cardiolipinas, ceramidas y fosfatidiletanolaminas (PE), con un aumento relativo de PE frente a PC. Estos patrones reflejan mecanismos de adaptación homeoviscosa mediante los cuales P. dumerilii ajusta la fluidez de sus membranas bajo condiciones térmicas variables. En conjunto, esta tesis aporta nuevo conocimiento sobre la capacidad biosintética de LC-PUFA en P. dumerilii, valida aproximaciones experimentales para el estudio funcional de genes clave y desvela mecanismos lipidómicos asociados a la adaptación a la temperatura. Estos hallazgos refuerzan el potencial de los poliquetos como recurso alternativo en la producción sostenible de LC-PUFA y ofrecen una base para futuras investigaciones en biología adaptativa y acuicultura.

[CA] Els àcids grassos poliinsaturats de cadena llarga (LC-PUFA, ≥ C20), com l’àcid araquidònic (ARA), l’àcid eicosapentaenoic (EPA) i l’àcid docosahexaenoic (DHA), són nutrients essencials per a nombrosos processos biològics en animals i, en particular, els LC-PUFA n-3 (EPA i DHA) proporcionen beneficis reconeguts per a la salut humana. Els peixos i mariscos marins en són les principals fonts dietètiques, i tradicionalment l’aqüicultura ha contribuït al seu subministrament. Tanmateix, la substitució progressiva d’ingredients marins per productes d’origen vegetal en els pinsos ha reduït de manera significativa el contingut de LC-PUFA n-3 en els productes aqüícoles, fet que ha generat un creixent interès per identificar fonts alternatives sostenibles. En aquest context, diversos invertebrats aquàtics han emergit com a candidats prometedors, atès que poden biosintetitzar de novo PUFA i LC-PUFA de rellevància nutricional. Entre ells, el poliquet Platynereis dumerilii s’ha consolidat com a model idoni, ja que posseeix desaturases de tipus methyl-end. L’objectiu general d’aquesta tesi ha estat comprendre els mecanismes fonamentals que sustenten la biosíntesi de LC-PUFA en poliquets, amb especial atenció a P. dumerilii. Es van definir quatre objectius específics: (1) investigar el repertori, les funcions enzimàtiques i l’evolució de les desaturases front-end; (2) caracteritzar les elongases (Elovl) implicades en la síntesi de LC-PUFA; (3) desenvolupar estratègies de disrupció gènica mitjançant CRISPR-Cas9 i avaluar la inhibició química de gens biosintètics; i (4) estudiar l’efecte de la temperatura sobre la composició d’àcids grassos i el lipidoma polar de P. dumerilii. Els resultats mostren que P. dumerilii té la capacitat completa per biosintetitzar de novo ARA i EPA, però no DHA. Es van identificar tres desaturases front-end (Fed1, Fed2 i Fed3) agrupades en dos clades filogenètics; Fed1 (activitat Δ5) i Fed2 (activitat Δ6 i Δ8) cobreixen totes les reaccions necessàries per a la síntesi de LC-PUFA a partir de precursors C18. A més, es van caracteritzar quatre elongases (Elovl2/5, dues Elovl4 i Elovl1/7) amb patrons d’expressió i afinitats de substrat complementàries. Una de les Elovl4 és extraordinàriament llarga per la presència d’un domini KH únic en animals i presenta expressió en fotoreceptors, la qual cosa suggereix un paper funcional en la visió. Les activitats enzimàtiques es van validar mitjançant expressió heteròloga en llevats, si bé aquest sistema presenta limitacions per inferir funcions in vivo. Per això, es van dissenyar sgRNA per a sis gens clau i es van aplicar mitjançant microinjecció d’embrions. L’assaig amb elovl2/5 va mostrar una alta eficiència mutagènica en larves, però no es van obtenir mutants viables en estadis juvenils, cosa que indica una possible funció essencial d’aquesta enzima. En paral·lel, es va provar l’inhibidor CP-24879, que va reduir l’activitat de tres desaturases, encara que la seua baixa especificitat en limita l’ús en estudis funcionals dirigits. Finalment, es va avaluar la resposta a la temperatura sobre els perfils lipídics. A 25 °C es va detectar un augment dels àcids grassos saturats i dels LC-PUFA n-6, mentre que a 15 °C van augmentar els lisofosfolípids, cardiolipines, ceramides i fosfatidiletanolamines (PE), amb un increment relatiu de PE respecte a PC. Aquests resultats indiquen mecanismes d’adaptació homeoviscosa mitjançant els quals P. dumerilii ajusta la fluïdesa i l’estabilitat de les membranes davant condicions tèrmiques variables. En conjunt, aquesta tesi aporta nou coneixement sobre la capacitat biosintètica de LC-PUFA en P. dumerilii, valida aproximacions experimentals per a l’estudi funcional de gens implicats i revela mecanismes adaptatius en el lipidoma associats a la temperatura. Aquestes troballes reforcen el potencial dels poliquets com a fonts alternatives i sostenibles de LC-PUFA en aqüicultura i contribueixen a aprofundir en la comprensió dels processos d’adaptació molecular en invertebrats marins.

[EN] Long-chain (≥ C20) polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA), including arachidonic acid (ARA), eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), are essential nutrients in many biological processes. Diets enriched in n-3 LC-PUFA, particularly EPA and DHA, provide recognised health benefits in a range of human pathologies. Marine fish and shellfish are the main dietary sources, and farmed fish have long contributed to their supply. However, the progressive replacement of marine ingredients by plant-based products in aquafeeds has markedly reduced n-3 LC-PUFA levels in aquaculture products, creating a need for sustainable alternatives. Aquatic invertebrates are promising candidates, as several lineages can biosynthesise PUFA de novo and produce LC-PUFA. Previous research showed that the nereid polychaete Platynereis dumerilii possesses methyl-end desaturases, establishing it as a suitable model. This thesis aimed to clarify the mechanisms of LC-PUFA biosynthesis in polychaetes, with a focus on P. dumerilii. Four objectives were set: (1) to characterise the repertoire, activities and evolutionary history of front-end desaturases; (2) to analyse Elovl elongases involved in LC-PUFA synthesis; (3) to develop gene-disruption approaches using CRISPR-Cas9 and chemical inhibition; and (4) to assess the effects of temperature on fatty acid composition and the polar lipidome. Results showed that P. dumerilii has the full enzymatic capacity to produce ARA and EPA de novo, but not DHA. Three front-end desaturases (Fed1, Fed2 and Fed3) were identified in two phylogenetic groups. Fed1 displayed Δ5 activity, enabling ARA and EPA synthesis from C20 precursors, whereas Fed2 had dual Δ6/Δ8 activities, generating substrates for Fed1. Together, Fed1 and Fed2 accounted for all desaturation reactions from C18 precursors (linoleic and α-linolenic acids), while Fed3 appeared functionally redundant. Four Elovl enzymes (Elovl2/5, Elovl1/7 and two Elovl4) were also characterised. Spatial expression analyses revealed tissue-specific patterns and complementary substrate preferences covering all elongation steps. Notably, one Elovl4 contained a unique KH domain in animals and was expressed in photoreceptors, suggesting a role in vision. Yeast heterologous expression confirmed desaturase and elongase activities, although in vivo roles required additional functional approaches. Six sgRNAs were designed, and microinjections with elovl2/5 sgRNA yielded high mutagenesis in larvae but no viable juveniles, suggesting that this elongase is essential, although methodological limitations cannot be excluded. The desaturase inhibitor CP-24879 reduced the activity of three enzymes but lacked sufficient specificity for precise functional analyses. Temperature strongly influenced lipid composition. At 25 °C, P. dumerilii showed increased levels of saturated fatty acids and n-6 LC-PUFA, including ARA, whereas n-3 LC-PUFA remained unchanged, suggesting selective activation of n-6 pathways. At 15 °C, lysophospholipids, cardiolipins, N-acyl ethanolamines, ceramides and phosphatidylethanolamines (PE) increased, with a higher PE:PC ratio indicative of membrane headgroup remodelling. These changes are consistent with homeoviscous adaptation, enabling poikilotherms to maintain membrane fluidity and homeostasis under thermal stress. In conclusion, this thesis provides an integrated framework for the enzymatic basis, functional genetics and environmental plasticity of LC-PUFA biosynthesis in P. dumerilii. It highlights the value of this species as a model for lipid metabolism, validates new experimental approaches and reveals mechanisms of temperature adaptation. The findings emphasise the potential of polychaetes as alternative, sustainable sources of n-3 LC-PUFA and contribute to a broader understanding of marine lipid ecology under climate change.