Desarrollo y validación de la tecnología EOSAL en el diagnóstico genético

[ES] La Distrofia muscular de Duchenne es una enfermedad genética causada por alteraciones en el gen DMD, que incluyen tanto variantes puntuales como variantes estructurales. Aproximadamente el 70 % de las alteraciones patogénicas descritas corresponden a deleciones y duplicaciones, lo que hace necesaria la aplicación de metodologías específicas para su detección y caracterización. En el primer capítulo de esta tesis se ha desarrollado y optimizado una nueva aproximación metodológica, denominada Easy One-Step Amplification and Labeling for CNV Detection (EOSAL-CNV), aplicada al análisis del gen DMD mediante análisis de fragmentos en un secuenciador capilar de ADN. La técnica se basa en una única reacción de PCR que permite la amplificación y el marcado fluorescente simultáneo de los fragmentos correspondientes a los 79 exones y la región promotora del gen DMD, junto con fragmentos control. El diseño del protocolo incluye cebadores específicos para cada región diana, a los que se les añade una secuencia universal y cebadores de amplificación de dicha secuencia universal, uno de ellos marcado con un fluoróforo. Esta estrategia posibilita la detección de múltiples fragmentos en una sola reacción, simplificando el flujo de trabajo y reduciendo costes y tiempo de análisis. Para validar la técnica se han evaluado 22 muestras con y sin variantes patogénicas previamente caracterizadas mediante la técnica de referencia, demostrando la capacidad de EOSAL-CNV para detectar de forma fiable variaciones en el número de copias en el gen DMD. En el segundo capítulo de esta tesis se aborda la adaptación y desarrollo de la tecnología EOSAL al ámbito de la secuenciación masiva de nueva generación (Next-Generation Sequencing, NGS). Siguiendo el mismo principio metodológico, se diseñó un panel de amplicones dirigido al análisis de variantes en el gen TP53. Inicialmente, el panel fue desarrollado mediante un enfoque convencional basado en dos reacciones de PCR consecutivas; posteriormente, se optimizó el protocolo mediante la metodología EOSAL-NGS. Esta optimización permite, en una única reacción de PCR, la amplificación simultánea de las regiones diana específicas y la incorporación de índices de marcado, lo que posibilita la preparación directa de las librerías para su secuenciación en plataformas Illumina. La validación de la técnica se llevó a cabo mediante el análisis de 26 muestras de pacientes con Leucemia linfocítica crónica (LLC) previamente caracterizadas por secuenciación de Sanger, lo que permitió evaluar la concordancia y el rendimiento del método propuesto. Por tanto, EOSAL-NGS ofrece una detección fiable de variantes, junto con las ventajas operativas de un flujo de trabajo simplificado, menor tiempo de manipulación y reducción del riesgo de contaminación, consolidándose como una alternativa eficiente para la secuenciación dirigida de TP53.

[EN] Duchenne muscular dystrophy is a genetic disorder caused by alterations in the DMD gene, including both single nucleotide variants and structural variants. Approximately 70% of the described pathogenic alterations correspond to deletions and duplications, making the application of specific methodologies necessary for their detection and characterization. In the first chapter of this thesis, a novel methodological approach, termed Easy One-Step Amplification and Labeling for CNV Detection (EOSAL-CNV), was developed and optimized for the analysis of the DMD gene through fragment analysis on a DNA sequencer. This technique is based on a single PCR reaction that enables the simultaneous amplification and fluorescent labeling of fragments corresponding to the 79 exons and the promoter region of the DMD gene, together with control fragments. The protocol design includes specific primers for each target region, to which a universal sequence is added, along with primers for the amplification of this universal sequence, one of which is labeled with a fluorophore. This strategy allows the detection of multiple fragments in a single reaction, simplifying the workflow and reducing both analysis time and costs. To validate the technique, 22 samples with and without pathogenic variants previously characterized using the reference method were evaluated, demonstrating the ability of EOSAL-CNV to reliably detect copy number variations in the DMD gene. The second chapter of this thesis addresses the adaptation and development of the EOSAL technology for application in next-generation sequencing (NGS). Following the same methodological principle, an amplicon panel was designed for the analysis of variants in the TP53 gene. Initially, the panel was developed using a conventional approach based on two consecutive PCR reactions; subsequently, the protocol was optimized using the EOSAL-NGS methodology. This optimization enables, within a single PCR reaction, the simultaneous amplification of specific target regions and the incorporation of indexing sequences, allowing the direct preparation of sequencing libraries for Illumina platforms. Validation of the technique was performed through the analysis of 26 samples from patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) previously characterized by Sanger sequencing, enabling the assessment of concordance and performance of the proposed method. Therefore, EOSAL-NGS provides reliable variant detection while offering operational advantages such as a simplified workflow, reduced hands-on time, and a lower risk of contamination, consolidating it as an efficient alternative for targeted sequencing of the TP53 gene.

[CA] La distròfia muscular de Duchenne és una malaltia genètica causada per alteracions en el gen DMD, que inclouen tant variants d'un sol nucleòtid com variants estructurals. Aproximadament el 70 % de les alteracions patogèniques descrites corresponen a delecions i duplicacions, fet que fa necessària l'aplicació de metodologies específiques per a la seua detecció i caracterització. En el primer capítol d'esta tesi s'ha desenvolupat i optimitzat una nova aproximació metodològica, denominada Easy One-Step Amplification and Labeling for CNV Detection (EOSAL-CNV), aplicada a l'anàlisi del gen DMD mitjançant anàlisi de fragments en un seqüenciador d'ADN. La tècnica es basa en una única reacció de PCR que permet l'amplificació i el marcatge fluorescent simultani dels fragments corresponents als 79 exons i a la regió promotora del gen DMD, juntament amb fragments control. El disseny del protocol inclou cebadors específics per a cada regió diana, als quals s'afegeix una seqüència universal, així com cebadors d'amplificació d'esta seqüència universal, un dels quals està marcat amb un fluoròfor. Esta estratègia possibilita la detecció de múltiples fragments en una sola reacció, simplificant el flux de treball i reduint els costos i el temps d'anàlisi. Per a validar la tècnica s'han avaluat 22 mostres amb i sense variants patogèniques prèviament caracteritzades mitjançant la tècnica de referència, demostrant la capacitat d'EOSAL-CNV per a detectar de manera fiable variacions en el nombre de còpies en el gen DMD. En el segon capítol d'esta tesi s'aborda l'adaptació i el desenvolupament de la tecnologia EOSAL a l'àmbit de la seqüenciació massiva de nova generació (Next-Generation Sequencing, NGS). Seguint el mateix principi metodològic, es va dissenyar un panell d'amplicons dirigit a l'anàlisi de variants en el gen TP53. Inicialment, el panell es va desenvolupar mitjançant un enfocament convencional basat en dues reaccions de PCR consecutives; posteriorment, el protocol es va optimitzar mitjançant la metodologia EOSAL-NGS. Esta optimització permet, en una única reacció de PCR, l'amplificació simultània de les regions diana específiques i la incorporació d'índexs de marcatge, la qual cosa possibilita la preparació directa de les llibreries per a la seua seqüenciació en plataformes Illumina. La validació de la tècnica es va dur a terme mitjançant l'anàlisi de 26 mostres de pacients amb leucèmia limfocítica crònica (LLC) prèviament caracteritzades per seqüenciació de Sanger, la qual cosa va permetre avaluar la concordança i el rendiment del mètode proposat. Per tant, EOSAL-NGS ofereix una detecció fiable de variants, juntament amb els avantatges operatius d'un flux de treball simplificat, un menor temps de manipulació i una reducció del risc de contaminació, consolidant-se com una alternativa eficient per a la seqüenciació dirigida del gen TP53.