Modulation of proteostasis in polyglutamine expansion disorders: the role of mitochondrial sirtuins and IP₃/Ca²⁺ signalling in C. elegans

Abstract

[ES] Las enfermedades neurodegenerativas son trastornos progresivos, complejos y actualmente incurables, caracterizados en gran medida por la alteración de la proteostasis, un proceso al que las neuronas son particularmente vulnerables. Las enfermedades por expansión de poliglutaminas (poliQ) están causadas por expansiones de repeticiones CAG. Como consecuencia, se generan proteínas mal plegadas propensas a la agregación que se acumulan en el cerebro, dando lugar a disfunción y degeneración neuronal. Entre ellas, la enfermedad de Huntington (EH) es la más prevalente. Está bien establecido que el trasfondo genómico de los individuos influye en la toxicidad y agregación proteica, con un impacto directo en la patología. Algunas variantes genéticas son protectoras y retrasan la aparición de los síntomas, mientras que otras aceleran la progresión de la enfermedad. La identificación de estos genes modificadores puede ser útil para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas. En esta tesis, se utilizó Caenorhabditis elegans como modelo in vivo para investigar las vías moleculares que regulan la proteostasis y la resiliencia neuronal, centrándonos especialmente en dos vías: las sirtuinas mitocondriales y la señalización del calcio dependiente de las fosfolipasas C (PLC). En el Capítulo 1 investigamos el papel de la sirtuina mitocondrial SIR-2.3, el ortólogo en C. elegans de SIRT4, en la toxicidad de poliQs y de la huntingtina mutante (mHTT). La pérdida de sir-2.3 redujo significativamente la agregación neuronal de poliQ y mejoró la función neuronal en gusanos que expresaban mHTT. Estos efectos protectores estuvieron mediados por la activación de AMPK y la autofagia, con contribuciones parciales de los factores de transcripción DAF-16/FOXO y NHR-49. Asimismo, el silenciamiento de SIRT4 en modelos celulares humanos también redujo la agregación insoluble de mHTT. La inhibición farmacológica de la ATP sintasa mediante tomatidina o bedaquilina reprodujo el fenotipo de la pérdida de sir-2.3 de manera dependiente de AMPK. En el Capítulo 2 abordamos el papel de la señalización del calcio mediada por PLC en el mantenimiento de la proteostasis. La pérdida de función de las isoformas de PLC en el gusano incrementó la agregación de poliQ y deterioró la función motora. Centrándonos en plc-1, el ortólogo de PLC¿ de mamíferos, demostramos que su pérdida exacerba la agregación y la disfunción neuronal a través de una señalización deficiente de calcio mediada por el receptor de IP¿ en C. elegans, itr-1. Además, la depleción de plc-1 aumentó la agregación de ¿-sinucleína, lo que sugiere un papel más amplio en la proteostasis más allá de los modelos poliQ. De forma inesperada, durante los experimentos del Capítulo 2 observamos que algunos mutantes de plc-1 desarrollaban quistes en el sistema excretor, similares a los observados en mutantes con defectos en la célula excretora. Esto nos llevó a investigar un posible papel de PLC-1 en la polaridad epitelial. El sistema excretor de C. elegans es un órgano tubular simple en forma de H con una célula excretora altamente polarizada. Encontramos que PLC-1 es necesario para la correcta formación del lumen e interactúa genéticamente con FLN-2 (el ortólogo del gusano de la filamina, una proteína organizadora del citoesqueleto de actina). PLC-1 y FLN-2 se localizan en la membrana apical y colocalizan con marcadores apicales de polaridad PAR, lo que sugiere que cooperan para mantener la estructura del citoesqueleto y la polaridad epitelial. En conclusión, esta tesis identifica vías genéticas y metabólicas conservadas que regulan la proteostasis y la resiliencia neuronal. Al descubrir nuevos roles para el eje SIRT4-AMPK y la señalización del calcio mediada por PLC-1, este trabajo aporta conocimiento mecanístico y propone nuevas dianas terapéuticas potenciales para la EH y otros trastornos neurodegenerativos relacionados.

[CA] Les malalties neurodegeneratives són trastorns progressius, complexos i actualment incurables, caracteritzats en gran mesura per l'alteració de la proteòstasi, un procés al qual les neurones són particularment vulnerables. Les malalties per expansió de poliglutamines (poliQ) estan causades per expansions de repeticions CAG. Com a conseqüència, es generen proteïnes mal plegades amb tendència agregar que s'acumulen al cervell, donant lloc a disfunció i degeneració neuronal. Entre aquestes, la malaltia de Huntington (MH) és la més prevalent. Està ben establit que el fons genòmic dels individus influeix en la toxicitat i l'agregació proteica, amb un impacte directe en la patologia. Algunes variants genètiques són protectores i retarden l'aparició dels símptomes, mentre que altres acceleren la progressió de la malaltia. La identificació d'aquests gens modificadors pot ser útil per al descobriment de noves dianes terapèutiques. En aquesta tesi, es va utilitzar Caenorhabditis elegans com a model in vivo per a investigar les vies moleculars que regulen la proteòstasi i la resiliència neuronal, centrant-nos especialment en dues vies: les sirtuïnes mitocondrials i la senyalització del calci dependent de les fosfolipases C (PLC). En el Capítol 1 vam investigar el paper de la sirtuïna mitocondrial SIR-2.3, l'ortòleg en C. elegans de SIRT4, en la toxicitat de les poliQ i de la huntingtina mutant (mHTT). La pèrdua de sir-2.3 va reduir significativament l'agregació neuronal de poliQ i va millorar la funció neuronal en nematods que expressaven mHTT. Aquests efectes protectors van estar mediats per l'activació d'AMPK i l'autofàgia, amb contribucions parcials dels factors de transcripció DAF-16/FOXO i NHR-49. Així mateix, el silenciament de SIRT4 en models cel·lulars humans també va reduir l'agregació insoluble de mHTT. La inhibició farmacològica de l'ATP sintasa mitjançant tomatidina o bedaquilina va reproduir el fenotip de la pèrdua de sir-2.3 de manera dependent d'AMPK. En el Capítol 2 vam abordar el paper de la senyalització del calci mediada per PLC en el manteniment de la proteòstasi. La pèrdua de funció de les isoformes de PLC va incrementar l'agregació de poliQ i va deteriorar la funció motora als nematods. Centrant-nos en plc-1, l'ortòleg de la PLC¿ dels mamífers, vam demostrar que la seua pèrdua exacerba l'agregació i la disfunció neuronal a través d'una senyalització del calci deficient mediada pel receptor d'IP¿ en C. elegans, ITR-1. A més, la depleció de plc-1 va augmentar l'agregació de l'¿-sinucleïna, el que suggereix un paper més ampli en la proteòstasi més enllà dels models de poliQ. De manera inesperada, durant els experiments del Capítol 2 vam observar que alguns mutants de plc-1 desenvolupaven quists en el sistema excretor, similars als observats en mutants amb defectes en la cèl·lula excretora. Això ens va portar a investigar un possible paper de PLC-1 en la polaritat epitelial. El sistema excretor de C. elegans és un òrgan tubular simple en forma de H amb una cèl·lula excretora altament polaritzada. Vam trobar que PLC-1 és necessari per a la correcta formació del lumen i que interactua genèticament amb FLN-2 (l'ortòleg del cuc de la filamina, una proteïna organitzadora del citoesquelet d'actina). PLC-1 i FLN-2 es localitzen a la membrana apical i colocalitzen amb marcadors apicals de polaritat PAR, la qual cosa suggereix que cooperen per a mantindre l'estructura del citoesquelet i la polaritat epitelial. En conclusió, aquesta tesi identifica vies genètiques i metabòliques conservades que regulen la proteòstasi i la resiliència neuronal. En descobrir nous rols per a l'eix SIRT4-AMPK i la senyalització del calci mediada per PLC-1, aquest treball aporta coneixement mecanístic i proposa noves dianes terapèutiques potencials per a la MH i altres trastorns neurodegeneratius relacionats.

[EN] Neurodegenerative diseases are progressive, complex and currently incurable disorders, largely characterized by the disruption of proteostasis, a process to which neurons are particularly vulnerable. Polyglutamine (polyQ) diseases are caused by CAG repeat expansions that generate aggregation-prone proteins with toxic gain-of-function properties. These aggregates impair cellular quality control systems, leading to neuronal dysfunction and degeneration. Huntington's disease (HD) is the most prevalent polyQ disorder. It is well known that the genomic background of individuals influences protein toxicity and aggregation, having an impact on the pathology. Some genes are protective, delaying the onset of symptoms, while others accelerate disease progression. Finding such modifier genes may be useful for the discovery of new therapeutic targets. In this thesis, Caenorhabditis elegans was used as an in vivo model to investigate molecular pathways that regulate proteostasis and neuronal resilience, with a particular focus on mitochondrial sirtuins and phospholipase C (PLC)-dependent calcium signalling. In Chapter 1, we investigated the role of the mitochondrial sirtuin SIR-2.3, the C. elegans orthologue of mammalian SIRT4, in polyQ and mutant huntingtin (mHTT) toxicity. Loss of sir-2.3 significantly reduced neuronal polyQ aggregation and improved neuronal function in worms expressing mHTT. These protective effects were mediated by activation of AMPK and autophagy, with partial contributions from the transcription factors DAF-16/FOXO and NHR-49. Importantly, SIRT4 knockdown in human cell models also reduced insoluble mHTT aggregation, indicating evolutionary conservation. Pharmacological inhibition of ATP synthase using tomatidine or bedaquiline phenocopied sir-2.3 loss in an AMPK-dependent manner, highlighting the SIRT4-AMPK axis as a key regulator linking mitochondrial metabolism, autophagy and neuronal proteostasis. Chapter 2 addressed the role of PLC-mediated calcium signalling in the maintenance of proteostasis. Disruption of multiple PLC isoforms increased polyQ aggregation and impaired motor function, indicating a conserved role for this pathway. Focusing on plc-1, the orthologue of mammalian PLC¿, we demonstrated that its loss exacerbates aggregation and neuronal dysfunction through impaired IP¿-ITR-1 calcium signalling. Furthermore, plc-1 depletion enhanced ¿-synuclein aggregation, suggesting a broader role in proteostasis beyond polyQ models. Unexpectedly, during the experiments of Chapter 2, we observed that some plc-1 mutants developed large cysts in the excretory system, reminiscent of excretory cell-defective mutants. This led us to investigate a role of PLC-1 in epithelial polarity. The C. elegans excretory system is a simple H-shaped tubular organ with a highly polarized excretory cell, making it an ideal model for studying apical-basal polarity. We found that PLC-1 is required for proper lumen formation and genetically interacts with FLN-2 (the worm orthologue of filamin, an actin-organizing protein). PLC-1 and FLN-2 localize to the apical membrane and colocalize with PAR polarity apical markers, suggesting they cooperate to maintain cytoskeletal structure and epithelial polarity. In conclusion, this thesis identifies conserved genetic and metabolic pathways that regulate proteostasis and neuronal resilience. By uncovering roles for the SIRT4-AMPK axis and PLC-1-calcium signalling, this work provides mechanistic insight and proposes new potential therapeutic targets for HD and related neurodegenerative disorders.