Integrated Phenotypic, Genomic, and Transcriptomic Approaches for the Precision Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

[ES] La Discinesia Ciliar Primaria (DCP) es una enfermedad respiratoria poco frecuente causada por alteraciones en la estructura o función de los cilios del epitelio respiratorio, que se traduce en una incapacidad para eliminar el moco de manera adecuada. La acumulación de estas secreciones en el tracto respiratorio favorece la aparición de infecciones, contribuyendo progresivamente al deterioro crónico del sistema respiratorio. Los pacientes con DCP suelen presentar heterotaxia o situs inversus y problemas de fertilidad.

El primer capítulo de esta tesis tiene como objetivo proporcionar una caracterización integral de una cohorte de 128 pacientes con DCP, mediante la integración de datos clínicos, genéticos, morfológicos y funcionales. Dado que ninguna técnica es capaz de diagnosticar todas las formas de DCP, este capítulo presenta el rendimiento diagnóstico de un algoritmo diagnóstico que combina la evaluación del batido ciliar mediante análisis de vídeo de alta velocidad, el estudio de la ultraestructura ciliar mediante microscopía electrónica de transmisión y el análisis genético mediante secuenciación del exoma clínico. Este algoritmo permitió el diagnóstico definitivo en el 72% de los casos, aunque solo el 58% de los pacientes presentó resultados positivos en los tres métodos diagnósticos. En conjunto, este estudio destaca el valor diagnóstico combinado de estas tres técnicas en pacientes con sospecha clínica de DCP, y refuerza la necesidad de un abordaje integrado y multidisciplinar.

El segundo capítulo describe la aplicación de la secuenciación del genoma completo (Whole Genome Sequencing, WGS) en sangre periférica y la secuenciación de ARN (RNA-seq) realizada directamente a partir de biopsias nasales como estrategia diagnóstica de segunda línea. Fue necesaria la validación del enfoque de RNA-seq para asegurar que el transcriptoma ciliar se capturaba de forma robusta. Con este fin, se obtuvieron biopsias nasales de 52 individuos, incluyendo 29 pacientes con DCP sin diagnóstico genético (grupo de estudio), ocho pacientes con DCP y diagnóstico genético confirmado (grupo control positivo) y 15 voluntarios sanos, incluidos para garantizar la robustez estadística. Mediante este enfoque, el transcriptoma ciliar se capturó de forma robusta en el 88% de las muestras. En el grupo control positivo, los hallazgos transcriptómicos fueron 100% concordantes con las variantes patogénicas previamente identificadas. Posteriormente, se aplicó WGS en sangre periférica en el grupo de estudio, y los resultados se analizaron en combinación con los del RNA-seq. Esta estrategia integradora permitió identificar la causa genética en el 30% de los casos, lo que representa un 7,5% adicional en el rendimiento diagnóstico global (8/107 familias). Las alteraciones patogénicas detectadas abarcaron un amplio espectro de variantes: cuatro variantes de nucleótido único en regiones exónicas (FOXJ1 n=1, HYDIN n=3), una variante profunda intrónica en CCDC40, dos variantes de número de copia que afectaban a RSPH1 y CFAP54, y una inserción intergénica de un elemento LINE en SPAG1. Además, se identificó en homocigosis una variante de corrimiento de la pauta de lectura en el gen candidato AK8 en un paciente.

El tercer capítulo presenta, por primera vez, la validación y adaptación transcultural al español del cuestionario de calidad de vida para pacientes adultos con DCP. Esto ha permitido su implementación en la práctica clínica, mejorando así el seguimiento y la atención de los pacientes adultos con DCP.

En conclusión, esta tesis ha permitido una evaluación exhaustiva del flujo diagnóstico de la DCP y su optimización, ampliar el conocimiento actual sobre la arquitectura genética de la DCP y la validación del cuestionario para evaluar la calidad de vida en pacientes adultos. En conjunto, estas contribuciones mejoran de manera sustancial el diagnóstico, la comprensión y el manejo clínico de la DCP.

[EN] Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a rare respiratory disease caused by alterations in the structure or function of the cilia in the respiratory epithelium, which is translated into an inability to effectively remove mucus. The accumulation of these secretions favours the onset of recurrent respiratory infections, which progressively contribute to chronic deterioration of the respiratory system. PCD patients often present with heterotaxy or situs inversus and fertility problems as well. Its diagnosis still remains challenging.

The first chapter of this thesis aims to provide a comprehensive characterisation of a cohort of 128 PCD patients by integrating clinical, genetic, morphological and functional data. This chapter presents the diagnostic yield of an algorithm that combines ciliary beat evaluation using high-speed video analysis (HSVA), ciliary ultrastructure assessment by transmission electron microscopy (TEM), and genetic analysis via clinical exome sequencing (CES). The implemented diagnostic algorithm enabled a definitive diagnosis in 72% of cases, although only 58% of patients showed positive results across all the three diagnostic methods. Overall, this study highlights the combinatory diagnostic value of HSVA, TEM and CES in a large series of patients with clinical suspicion of PCD, and reinforces the need for an integrated, multidisciplinary approach to achieve an accurate and timely diagnosis.

The second chapter describes the application of Whole Genome Sequencing (WGS) on peripheral blood and RNA sequencing (RNA-seq) directly performed on nasal biopsy as a second-tier diagnostic strategy for PCD patients who remained genetically unsolved after exome sequencing. Validation of the RNA-seq approach was required to ensure that the ciliary transcriptome was robustly captured. To this end, nasal biopsies were obtained from 52 individuals, including 29 genetically undiagnosed PCD patients from the previous chapter (study group), eight PCD patients with a confirmed genetic diagnosis (positive control group), and 15 healthy volunteers included to ensure statistical robustness. Using this approach, the ciliary transcriptome was successfully captured in 88% of the samples. In the positive control group, transcriptomic outliers were 100% concordant with the previously identified pathogenic variants. Subsequently, WGS on peripheral blood was applied in the study group and analysed in combination with RNA-seq. This integrative strategy enabled the identification of the underlying genetic cause in 30% of these cases, representing an additional 7.5% diagnosis yield in the overall cohort (8/107). The pathogenic alterations detected encompassed a broad spectrum of variant types: four single-nucleotide variants in exonic regions (FOXJ1 n=1, HYDIN n=3), one deep intronic SNV in CCDC40, two copy-number variants affecting RSPH1 and CFAP54, and an intergenic insertion of a LINE element disrupting the SPAG1 sequence. Additionally, a frameshift variant in the candidate PCD-gene AK8 was also identified in homozygosity in one patient.

The third chapter presents, for the first time, the validation and transcultural adaptation into Spanish of the quality-of-life (QoL) questionnaire for adult patients with PCD. Thus, this questionnaire can now be implemented into clinical practice, thereby improving the management and follow-up of adult PCD patients.

In conclusion, this thesis has enabled a comprehensive evaluation and optimisation of the PCD diagnostic workflow implemented in our centre, has expanded current knowledge of the genetic architecture of PCD, and validated a standardised instrument for assessing quality of life in adult patients with PCD. Collectively, these contributions substantially enhance the diagnosis, understanding and clinical management of PCD.

[CA] La Discinèsia Ciliar Primària (DCP) és una malaltia respiratòria poc freqüent causada per alteracions en l'estructura o la funció dels cilis de l'epiteli respiratori, que es tradueix en una incapacitat per a eliminar adequadament el moc. L'acumulació d'estes secrecions mucoses en el tracte respiratori afavoreix l'aparició d'infeccions, contribuint progressivament al deteriorament crònic del sistema respiratori. Els pacients amb DCP solen presentar heterotaxia o situs inversus i problemes de fertilitat.

El primer capítol d'esta tesi té com a objectiu proporcionar una caracterització integral d'una cohort de 128 pacients amb DCP, mitjançant la integració de dades clíniques, genètiques, morfològiques i funcionals. Basant-se en l'absència d'una prova definitiva per al diagnòstic de la DCP, este capítol avalúa el rendiment diagnòstic d'un algoritme que combina l'anàlisi del batre ciliar mitjançant un sistema de vídeo-imatge d'alta velocitat, l'estudi de l'ultraestructura ciliar amb microscòpia electrònica de transmissió i l'anàlisi genètica mitjançant la seqüenciació de l'exoma clínic. Aquest algoritme va permetre el diagnòstic definitiu en el 72% dels casos, encara que només el 58% dels pacients va presentar resultats positius en els tres mètodes diagnòstics. En conjunt, este estudi destaca el valor diagnòstic combinat de les tres tècniques en pacients amb sospita clínica de DCP, i reforça la necessitat d'un abordatge integrat i multidisciplinari.

El segon capítol descriu l'aplicació de la seqüenciació del genoma complet (WGS: Whole Genome Sequencing, WGS) en sang perifèrica i la seqüenciació d'ARN (RNA-seq) realitzada directament a partir de biòpsies nasals com a estratègia diagnòstica de segona línia. Va ser necessària la validació de l'enfocament d'RNA-seq per tal d'assegurar que el transcriptoma ciliar es capturava de manera robusta. Amb aquesta finalitat, es van obtindre biòpsies nasals de 52 individus, inclosos 29 pacients amb DCP sense diagnòstic genètic previ del capítol anterior (grup d'estudi), huit pacients amb DCP i diagnòstic genètic confirmat (grup control positiu) i 15 voluntaris sans, inclosos per a garantir la robustesa estadística. Mitjançant aquest enfocament, el transcriptoma ciliar es va capturar de manera robusta en el 88% de les mostres. En el grup control positiu, els valors atípics transcriptòmics van ser 100% concordants amb les variants patogèniques prèviament identificades. Posteriorment, es va aplicar WGS en sang perifèrica en el grup d'estudi, i els resultats es van analitzar conjuntament amb l'RNA-seq. Esta estratègia dual va permetre identificar la causa genètica en el 30% dels casos, la qual cosa representa un 7,5% addicional en el rendiment diagnòstic global (8/107 famílies). Les alteracions patogèniques detectades van incloure un ampli espectre de variants: quatre variants de nucleòtid únic en regions exòniques (FOXJ1 n=1, HYDIN n=3), una variant intrònica profunda en CCDC40, dos variants del nombre de còpies que afectaven RSPH1 i CFAP54, i una inserció intergènica d'un element LINE en SPAG1. A més a més, es va identificar en homozigosi una variant de corriment de la pauta de lectura en el gen candidat AK8 en un pacient.

El tercer capítol presenta, per primera vegada, la validació i adaptació transcultural al castellà del qüestionari de qualitat de vida per a pacients adults amb DCP. Això ha permet la seua implementació en la pràctica clínica, millorant així el seguiment i l'atenció dels pacients adults amb DCP.

En conclusió, esta tesi ha permés una avaluació exhaustiva del flux diagnòstic de la DCP implementat en el nostre centre i la seua optimització, ha ampliat el coneixement actual sobre l'arquitectura genètica de la DCP, i ha validat un instrument estandarditzat per a avaluar la qualitat de vida en pacients adults amb aquesta malaltia. En conjunt, estes contribucions milloren de manera substancial el diagnòstic, la comprensió i el maneig clínic de la DCP.