Novel Insights into the Viral Movement and Host Factors Interactions of Alfalfa Mosaic Virus and Biotechnological Applications of 30K Movement Proteins

[ES] Los virus de plantas provocan importantes pérdidas en el sector agrícola, por lo que comprender su biología es clave para desarrollar estrategias de control. Un aspecto crucial en las infecciones virales es el movimiento sistémico, que permite la propagación del virus dentro de la planta. Para profundizar en los aspectos del transporte sistémico, se realizó un experimento de evolución compensatoria con una construcción derivada del RNA3 de AMV defectuosa en el movimiento sistémico. En este experimento, ciertos linajes virales recuperaron la capacidad de moverse sistémicamente tras varios pases. En estos linajes, se observaron mutaciones en la región no traducible 5' (5'UTR). Los 5'UTR evolucionados poseían una menor afinidad por la proteína de cubierta (CP), y generaban una menor acumulación de partículas virales. Además, los 5'UTR evolucionados permitieron el movimiento sistémico de versiones del RNA3 con una CP mutada, incapaz de formar partículas virales, lo que sugiere que la encapsidación no es esencial para el movimiento sistémico. El silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) es una herramienta fundamental para estudiar la funcionalidad génica en plantas. En esta tesis se desarrolló un nuevo enfoque para generar vectores VIGS modificando MPs de la familia 30K. Este método se probó en AMV, el virus del mosaico del pepino (CMV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV); en plantas de Nicotiana tabacum y N. benthamiana. Los ensayos permitieron establecer una correlación entre el tamaño del inserto y la eficacia del silenciamiento: los insertos de 45-54 pb consiguieron silenciar el gen de la fitoeno desaturasa (PDS) en un 75-90 %, mientras que los insertos más pequeños (21-39 pb) mostraron un silenciamiento del 45 %. También se detectó una relación inversa entre la eficiencia del silenciamiento y la encapsidación viral, resaltando la importancia de la encapsidación en el diseño de vectores VIGS. Otro aspecto clave de la infección es la interacción entre proteínas virales y factores del hospedador. En esta tesis se empleó una estrategia novedosa para identificar factores del hospedador que interaccionan con MPs de la familia 30K. Mediante esta estrategia se identificaron 121 posibles interactores de la MP de AMV en N. tabacum, validando cinco mediante ensayos BiFC: una histona 2 B (H2B), una actina, una proteína 14-3-3A, un factor de iniciación eucariota 4A (eIF4A) y una peroxidasa. Los resultados obtenidos sugieren que algunos de estos factores podrían formar parte de complejos multiproteicos asociados a la MP de AMV, mientras que otros interactúan también con otras MPs de la familia 30K, evidenciando la existencia de interactores comunes en el grupo 30K. La proteína H2B se seleccionó para realizar un análisis más profundo. Los resultados mostraron que la H2B interacciona con MPs de la familia 30K y del doble bloque genético, siendo las regiones N-terminales clave en esta interacción. El silenciamiento del gen H2B.1 en Nicotiana benthamiana redujo la acumulación viral y aumentó las hormonas de defensa, como el ácido salicílico (SA) y el ácido abscísico (ABA). La interrupción de la interacción MP-H2B mediante ensayos de competencia también disminuyó los títulos virales, indicando que esta interacción es esencial para la infección. Además, las infecciones virales alteraron la localización nuclear de H2B y la expresión de variantes específicas de H2B, lo que sugiere que ciertas variantes H2B desempeñan roles específicos en la respuesta frente a virus. En conjunto, esta tesis aporta conocimientos relevantes sobre el movimiento sistémico viral, las interacciones entre MPs de la familia 30K y factores del huésped, además de presentar una nueva estrategia para el desarrollo de vectores VIGS. Estos hallazgos podrían tener distintas implicaciones tanto en investigación básica como en investigación aplicada en el sector agrícola, lo que, en última instancia, podría contribuir a la obtención de plantas resistentes a virus.

[CA] Els virus de plantes causen pèrdues significatives en l'agricultura. Comprendre els seus mecanismes moleculars és essencial per a desenrotllar estratègies de control efectives. Un aspecte clau de la infecció viral és el moviment sistèmic, que permet la disseminació del virus dins de la planta i la seua propagació a altres hostes. Per a aprofundir en este aspecte, es va realitzar un experiment d'evolució compensatòria amb un RNA 3 de AMV defectuós en el moviment sistèmic però capaç de moure's de cèl·lula a cèl·lula. Alguns llinatges virals van recuperar la capacitat de transport sistèmic després de diverses passades. L'anàlisi va revelar mutacions en la regió 5' UTR, que reduïen l'afinitat per la proteïna de coberta (CP) i disminuïen l'acumulació de partícules virals. A més, estes mutacions van permetre el moviment sistèmic fins i tot en una versió del RNA 3 amb una CP mutada, suggerint que la formació de virions no és essencial per al transport a llarga distància. També es va observar un augment del moviment sistèmic en variants de AMV amb MPs d'altres virus de la família 30K, reforçant la hipòtesi que l'encapsidació no és un requisit absolut per a este procés. El silenciament gènic induït per virus (VIGS) és una eina potent per a l'estudi funcional de gens en plantes d'importància agrícola. En esta tesi es va desenrotllar una estratègia nova per a generar vectors VIGS modificant les MPs de la família 30K, que inclou més de 500 espècies víriques que infecten cultius rellevants. La incorporació de seqüències heteròlogues en les MPs es va provar en AMV, el virus del mosaic del cogombre (CMV) i el virus del mosaic del tabac (TMV). Els assajos en Nicotiana tabacum i N. benthamiana van demostrar que insercions de 45-54 pb en les MPs aconseguien un silenciament del gen PDS del 75-90 %, amb un fenotip clar d'emblanquiment. Insercions més curtes (21-39 pb) van mostrar una eficàcia menor (¿45 %), mentre que fragments inferiors a 21 pb no induïen cap silenciament. A més, es va trobar una relació inversa entre l'eficàcia del silenciament i la capacitat d'encapsidació del virus, ressaltant la influència d'este procés en el disseny de vectors VIGS. Un altre aspecte fonamental de la infecció viral és la interacció entre factors de l'hoste i proteïnes víriques. Mitjançant una estratègia basada en immunoprecipitació durant la infecció natural en N. tabacum, es van identificar 121 possibles interactors de la MP d'AMV. D'estos, cinc van ser validats per complementació bimolecular de fluorescència (BiFC): H2B, actina, 14-3-3A, eIF4A i POX. L'anàlisi detallada d'H2B va mostrar que esta histona interacciona amb MPs de diversos gèneres vírics, incloent-hi la família 30K i les MPs del doble bloc genètic. El mapatge de la interacció va revelar que les regions N-terminals de totes dues proteïnes són essencials. El silenciament del gen H2B.1 en N. benthamiana va reduir els títols virals i va incrementar els nivells d'hormones defensives com SA i ABA. A més, la interrupció de la interacció MP-H2B mitjançant assajos de competència va provocar una reducció addicional de la càrrega viral, destacant la seua rellevància en la patogènesi viral. També es va observar que les infeccions víriques alteraven la localització nuclear d'H2B i l'expressió de variants específiques, suggerint que algunes podrien tindre rols concrets en la resposta de la planta als virus. En conjunt, esta tesi proporciona noves dades sobre el moviment sistèmic viral i la interacció entre MPs de la família 30K i factors de l'hoste. A més, presenta una estratègia innovadora per al desenrotllament de vectors VIGS mitjançant la modificació de les MPs. Estes troballes podrien tindre aplicacions tant en investigació bàsica com en biotecnologia agrícola, contribuint al desenrotllament de cultius amb major resistència als virus.

[EN] Viruses cause substantial losses in agricultural crops, making it essential to understand their biology for developing control strategies and biotechnological tools. One key aspect of plant virus infection is systemic movement through vascular tissues, but many details remain unclear. In alfalfa mosaic virus (AMV), the coat protein (CP) plays a major role in long-distance transport, yet its precise function remains unknown. To investigate this, a compensatory evolution experiment was conducted using an AMV RNA3 construct defective in systemic transport. After several passages, some viral lineages regained the ability for systemic movement, revealing mutations in the 5' untranslated region (5'UTR). These evolved 5'UTRs had reduced CP affinity and lower virus particle accumulation, but still enabled systemic movement, even when CP was mutated and unable to form particles, indicating that encapsidation is not essential for systemic transport. Additionally, movement proteins (MPs) from the 30K family enhanced systemic transport in the evolved AMV constructs. Virus-induced gene silencing (VIGS) is a powerful tool for functional studies in agriculturally important crops. This thesis developed a novel VIGS approach using viruses with 30K family MPs as vectors. The 30K MP family includes 20 viral genera and over 500 species, which infect most major crops. MPs from AMV, cucumber mosaic virus (CMV), and tobacco mosaic virus (TMV) were modified to incorporate target gene sequences. In Nicotiana tabacum and N. benthamiana, insert sizes correlated with silencing efficiency: 45-54 bp inserts achieved 75-90% silencing of the phytoene desaturase (PDS) gene, while 21-39 bp fragments resulted in 45% silencing without visible phenotypes. Inserts shorter than 21 bp did not induce silencing. Notably, silencing efficiency was inversely correlated with viral encapsidation efficiency, emphasizing its importance in VIGS vector design. Host factors interacting with viral proteins are another crucial aspect of infection. This study employed a novel strategy to identify host factors in N. tabacum that interact with 30K family MPs. For this purpose, tags were added to the AMV MP coding sequence without affecting its functionality, enabling the identification of 121 potential interactors through immunoprecipitation. Five candidates¿histone H2B, actin, 14-3-3A protein, eukaryotic initiation factor 4A (eIF4A), and a peroxidase (POX)¿were validated using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Furthermore, some of these factors appeared to form protein complexes with AMV MP, while others interacted with MPs from different 30K viruses, suggesting shared host interactors among this MP family. H2B was further analyzed due to its emerging role in plant-pathogen interactions. H2B was found to interact with MPs from various viral genera, including 30K MPs and double gene block MPs. Mapping experiments revealed that AMV MP and H2B interact via their N-terminal regions. Silencing the H2B.1 gene in N. benthamiana significantly reduced viral titers and increased levels of defense-related hormones, such as salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA). Disrupting the MP-H2B interaction further decreased viral accumulation, underscoring its importance in infection. Viral infections also altered H2B's nuclear localization and the expression patterns of specific H2B variants, suggesting distinct roles in the host response. Collectively, this thesis advances our understanding of viral movement mechanisms, identifies novel host factors interacting with 30K family MPs, and refines a strategy for using modified 30K MPs as VIGS vectors. These findings have broad implications for both basic research and agricultural applications by contributing to the development of broad-spectrum resistance strategies against RNA viruses.