ParPMC Genes and Beyond: Unravelling PPV Resistance in Apricot

Abstract

[ES] La sharka, causada por el Plum pox virus (PPV), representa la mayor amenaza para la producción de frutales de hueso a nivel mundial, y el desarrollo de cultivares resistentes sigue siendo la estrategia de control más sostenible. A pesar de los numerosos avances, la base molecular de la resistencia al PPV aún no se comprende completamente. En albaricoquero (Prunus armeniaca L.), se ha identificado un locus mayor de resistencia (PPVres) en el cromosoma 1. Dentro de esta región, dos genes parálogos, ParPMC1 y ParPMC2, presentan variantes de secuencia asociadas a la resistencia al PPV. En particular, el alelo resistente de ParPMC2 contiene una deleción de 5 pb en el exón 2 que provoca un cambio en la pauta de lectura y se predice que causa la pérdida de función. Los cultivares portadores de este alelo muestran una reducción significativa de la expresión tanto de ParPMC2 como, de forma más acusada, de ParPMC1. Esta tesis proporciona un marco integrado molecular y genético para explicar la resistencia al PPV en albaricoquero. La primera parte del trabajo se centró en la caracterización molecular de los genes ParPMC y su papel como factores de susceptibilidad del hospedador. Los análisis de expresión revelaron altos niveles de transcritos en tejidos vasculares de cultivares susceptibles, lo que sugiere su implicación en el movimiento sistémico del virus. Los ensayos de localización subcelular mostraron que ParPMC1 se localiza en el citoplasma y el núcleo, mientras que ParPMC2 se asocia principalmente a la envoltura nuclear; ambos presentan cambios de localización tras la infección por PPV. Estos resultados apuntan a una posible participación en procesos de transporte nucleocitoplasmático y replicación viral. Los ensayos funcionales en Nicotiana benthamiana demostraron que el silenciamiento de NbPMC, el único ortólogo de ParPMC, reduce significativamente la acumulación y diseminación sistémica del PPV, confirmando su papel como factores de susceptibilidad. Los análisis de interacción proteína-proteína identificaron múltiples interactores de ParPMC1 y ParPMC2. Entre ellos, eEF1A fue validado funcionalmente en N. benthamiana, donde su silenciamiento provocó una marcada reducción de la infección sistémica por PPV. Junto con los datos de localización, estos resultados sugieren que ParPMC1 podría actuar como proteína adaptadora, reclutando eEF1A a sitios de replicación asociados al retículo endoplasmático. Los análisis de biología de sistemas apoyan la divergencia funcional entre ambos parálogos: ParPMC1 se asoció a fotosíntesis y metabolismo del ARN, mientras que ParPMC2 se relacionó con la biosíntesis de aminoácidos y folatos. La integración de los interactores en redes Arabidopsis-potyvirus indicó posibles conexiones con vías del proteasoma. La segunda parte de la tesis abordó la base genética y su aplicación en mejora vegetal. Se desarrolló un sistema eficiente de selección asistida por marcadores basado en la detección del alelo ParPMC2-del. Sin embargo, las inconsistencias genotipo-fenotipo revelaron la participación de factores adicionales. El análisis de poblaciones segregantes mostró que la combinación de haplotipos resistentes y susceptibles en PPVres influye en el grado de resistencia. La incorporación de información del haplotipo susceptible mejoró la capacidad predictiva. El mapeo de QTL confirmó el efecto mayor de PPVres e identificó loci menores en los cromosomas 6 y 7. En conjunto, este trabajo conecta los mecanismos moleculares de susceptibilidad con la arquitectura genética de la resistencia al PPV, aportando bases sólidas para estrategias de mejora más precisas y el desarrollo de cultivares más resilientes.

[CA] La sharka, causada pel Plum pox virus (PPV), és la principal limitació per a la producció de fruiters de pinyol a escala mundial, i l'obtenció de cultivars resistents continua sent l'estratègia de control més sostenible. Tot i això, la base molecular de la resistència al PPV encara no es comprén completament. En albercoquer (Prunus armeniaca L.) s'ha identificat un locus major de resistència, PPVres, localitzat al cromosoma 1. En aquesta regió, els gens paràlegs ParPMC1 i ParPMC2 presenten variants associades a la resistència. L'al·lel resistent de ParPMC2 conté una deleció de 5 pb a l'exó 2 que provoca un canvi de marc de lectura i una probable pèrdua de funció. Els cultivars portadors d'aquest al·lel mostren una forta reducció en l'expressió de ParPMC2 i, especialment, de ParPMC1. En aquest context, aquesta tesi aporta una visió integrada dels mecanismes moleculars i genètics implicats en la resistència al PPV en albercoquer. La primera part del treball es va centrar en la caracterització molecular dels gens ParPMC com a factors de susceptibilitat. Els anàlisis d'expressió van mostrar nivells elevats en teixits vasculars de genotips susceptibles, fet que suggereix la seua implicació en el moviment sistèmic del virus. Els estudis de localització subcel·lular van revelar que ParPMC1 es localitza al citoplasma i al nucli, mentre que ParPMC2 s'associa principalment amb l'embolcall nuclear; ambdós modifiquen la seua localització després de la infecció per PPV. Els assajos funcionals en Nicotiana benthamiana van demostrar que el silenciament de NbPMC, el seu ortòleg, redueix significativament l'acumulació i la disseminació del PPV, confirmant el seu paper com a factors de susceptibilitat. Els estudis d'interacció proteïna-proteïna van identificar diversos interactors de ParPMC1 i ParPMC2, entre ells eEF1A, la validació funcional del qual va mostrar que el seu silenciament redueix notablement la infecció sistèmica per PPV. En conjunt, els resultats suggereixen que ParPMC1 podria actuar com a proteïna adaptadora, facilitant la replicació viral en llocs associats al reticle endoplasmàtic. Els anàlisis de biologia de sistemes van evidenciar una divergència funcional entre ambdós paràlegs: ParPMC1 es va associar amb fotosíntesi i metabolisme de l'ARN, mentre que ParPMC2 es va relacionar amb la biosíntesi d'aminoàcids i folats. La integració dels interactors en xarxes Arabidopsis-potyvirus va indicar possibles connexions amb vies del proteasoma. La segona part de la tesi va abordar la base genètica i la seua aplicació en millora vegetal. Es va desenvolupar un sistema eficient de selecció assistida per marcadors basat en la detecció de l'al·lel ParPMC2-del. Tanmateix, les inconsistències genotip-fenotip van revelar la participació de factors addicionals. L'anàlisi de poblacions segregants va mostrar que la combinació d'haplotips resistents i susceptibles en PPVres influeix en el grau de resistència. La incorporació d'informació de l'haplotip susceptible va millorar la capacitat predictiva. El mapatge de QTL va confirmar l'efecte major de PPVres i va identificar loci menors als cromosomes 6 i 7. En conjunt, aquest treball connecta els mecanismes moleculars de susceptibilitat amb l'arquitectura genètica de la resistència al PPV, i aporta bases sòlides per a estratègies de millora més precises i el desenvolupament de cultivars més resilients.

[EN] Sharka disease, caused by Plum pox virus (PPV), represents the most severe threat to stone fruit production worldwide, and breeding resistant cultivars remains the most sustainable control strategy. Despite extensive research, the molecular basis of PPV resistance is still not fully understood. In apricot (Prunus armeniaca L.), a major resistance locus (PPVres) has been mapped to chromosome 1. Within this region, two paralogous genes, ParPMC1 and ParPMC2, harbor sequence variants associated with PPV resistance. Notably, the resistant allele of ParPMC2 contains a 5-bp deletion in exon 2 that introduces a frameshift mutation predicted to result in loss of function. Cultivars carrying this allele show strongly reduced expression of both ParPMC2 and, more markedly, ParPMC1. In this context, this thesis provides an integrated molecular and genetic framework to explain PPV resistance in apricot. The first part of this work addressed the molecular characterization of ParPMC genes and their role as host susceptibility factors. Expression analyses revealed high transcript levels of both genes in vascular tissues of susceptible cultivars, suggesting a role in long-distance viral movement. Subcellular localization assays showed that ParPMC1 localizes to the cytoplasm and nucleus, whereas ParPMC2 is mainly associated with the nuclear envelope; both proteins exhibited altered localization upon PPV infection. These results point to a potential involvement in nucleocytoplasmic trafficking and viral replication. Functional assays in Nicotiana benthamiana demonstrated that silencing of NbPMC, the single ortholog of ParPMC, significantly reduced PPV accumulation and systemic spread, confirming their role as susceptibility factors. Protein-protein interaction analyses identified multiple interactors of ParPMC1 and ParPMC2. Among them, eEF1A was functionally validated in N. benthamiana, where its silencing led to a strong reduction in PPV systemic infection. Combined with localization data, these findings suggest that ParPMC1 may act as an adaptor recruiting eEF1A to endoplasmic reticulum-associated replication sites. Systems biology analyses further supported functional divergence between ParPMC paralogs: ParPMC1 was associated with photosynthesis and RNA metabolism, whereas ParPMC2 clustered with amino acid and folate biosynthesis pathways. Integration of ParPMC interactors into Arabidopsis-potyvirus interaction networks highlighted links to proteasome-associated proteins, suggesting that PPV may exploit host protein degradation pathways during infection. The second part of the thesis focused on the genetic basis and breeding applications of PPV resistance. A robust and cost-effective marker-assisted selection system was developed based on allele-specific detection of ParPMC2-del. However, genotype-phenotype inconsistencies revealed the contribution of additional genetic factors. Analysis of segregating populations showed that combinations of resistant and susceptible haplotypes at PPVres influence resistance levels, with haplotype similarity affecting silencing efficiency. Incorporating susceptible haplotype information improved prediction accuracy. QTL mapping confirmed the major effect of PPVres and identified minor loci on chromosomes 6 and 7, some of which colocalize with ParPMC interactors. Overall, this work links molecular susceptibility mechanisms with the genetic architecture of PPV resistance in apricot, providing insights that support the development of improved breeding strategies and more resilient cultivars.