Búsqueda de modificadores de susceptibilidad a crisis epilépticas y anormalidades de comportamiento en un modelo de Drosophila melanogaster con mutaciones del gen para

Abstract

La epilepsia corresponde a una de las condiciones neurológicas más incapacitantes en cualquier rango de edad, cerca de un 1% de la población padece esta enfermedad y hasta un tercio de los afectados no responden a las medicaciones antiepilépticas convencionales. El Síndrome de Dravet (SD) es uno de estos tipos de epilepsia de muy difícil tratamiento, con múltiples tipos de crisis pobremente controladas y con deterioro progresivo del funcionamiento neurológico global. Es por ello, que la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas que permitan reducir o controlar totalmente las crisis en los pacientes con SD, resulta importante para la investigación biomédica. Una de las aproximaciones más interesantes en este aspecto, es el análisis de posibles genes modificadores que al ser modulados puedan cambiar la evolución del fenotipo epiléptico.

El objetivo principal de nuestro trabajo es la evaluación del efecto del silenciamiento de un grupo de posibles genes modificadores del fenotipo paralítico en la mosca Drosophila melanogaster con mutaciones parabss1 como modelo animal del SD. Luego de una amplia revisión bibliográfica se seleccionaron 21 genes humanos distribuidos en 3 grupos de candidatos que incluían: 1) genes relacionados con la formación de circuitos neuronales en epilepsia primaria, 2) genes modificadores de los genes SCN1A y SCN2A; y, 3) genes reguladores de la formación de circuitos y redes de señalización neuronales durante el neurodesarrollo. Para cada una de las proteínas producto de los genes elegidos, se determinó el grado de homología con las proteínas en la mosca Drosophila y, según los resultados de este análisis, se escogieron 13 genes para realizar los experimentos.

Luego de varios cruces entre distintas cepas se consiguieron los 2 genotipos necesarios para la fase de test: el genotipo control parabss1 y sus hermanas parabss1 con ARNi para cada gen seleccionado. Estos grupos de moscas fueron sometidas a los ensayos de sensibilidad a la vibración y al aumento de temperatura. En cada experimento, se midió, para ambos grupos, el número de moscas afectadas por crisis, el tiempo de latencia, la duración de las crisis y el período de recuperación. Además, utilizamos como control positivo moscas con la mutación gish04895 o con ARNi para este gen, ya que éste es un supresor parcial del fenotipo parabss1.

El ensayo de sensibilidad a la vibración fue muy útil para encontrar los potenciales modificadores. Sin embargo, la prueba de sensibilidad a la temperatura no fue tan exitosa, ya que más de la mitad de las moscas no mostraron cambios en el comportamiento. Este hecho nos sugirió que este tipo de experimento no es el más resolutivo para nuestro objetivo y, por lo tanto los datos obtenidos, aunque muestran ciertas tendencias, no son conclusivos.

Los resultados en el ensayo de sensibilidad a la vibración mostraron que seis de los genes evaluados tenían un perfil supresor parcial del fenotipo epiléptico (nAchR¿1, CG8916, Clc-a, Ca-ß, pdp1 y Ca-¿1T) y que dos de los genes evaluados fueron potenciadores (Sh y KCNQ). Sin embargo, cuatro grupos de moscas control (Slo, nAchR¿4, Lcch3 y cac) fallaron al realizar el estímulo de vibración y, por lo tanto, los datos obtenidos no son confiables. Además, el gen Toy no se pudo evaluar en los experimentos dado que, aunque se logró obtener moscas hijas con el fenotipo deseado, éstas fallecieron tempranamente sin poder ser reemplazadas.

Luego del análisis de los datos obtenidos, podemos concluir que identificamos tres posibles nuevos genes supresores y dos potenciadores. Los potenciales supresores son nAchR¿1, CG8916 y Clc-a, siendo los dos primeros los que mostraron una mejoría importante en el número de moscas afectadas, en el tiempo de duración de crisis y de recuperación. Los intensificadores podrían ser Sh y KCNQ. Siendo Sh el gen que mostró un perfil más claro con un aumento significativo del número

Epilepsy is one of the most incapacitating neurological conditions at any age, about 1% of the population suffers from this disease and up to a third of those affected do not respond to conventional antiepileptic medications. Dravet Syndrome (DS) is one of these types of epilepsy that are very difficult to treat, with poorly controlled seizures and progressive neurological deterioration. For those reasons, the search for new therapeutic targets that can reduce or fully control the seizures in patients with this syndrome is really important for biomedical research. One of the most interesting approaches is the analysis of possible genetic modifiers that can change the evolution of the epileptic phenotype.

The main objective of our study is to evaluate the effect of silencing a group of possible genetic modifiers of the paralytic phenotype in the Drosophila melanogaster fly with parabss1 mutation as animal model of SD. After a large bibliographic review, we chose 21 human genes as candidates and they were distributed in the 3 following groups: 1) genes related with the formation of neuronal circuits in primary epilepsy, 2) genes that modify SCN1A and SCN2A genes; and, 3) regulatory genes in the formation of neural circuits and networks during neurodevelopment. Next, we establish the homology between each of the produced proteins from the selected human genes, and the proteins in Drosophila fly. According to the results of this analysis, we select only 13 genes to perform the assays.

After several crosses between different strains, we obtained the two necessary genotypes for the test phase: the control genotype parabss1 and its sister¿s parabss1 with RNAi for each selected gene. These groups of flies were submitted to the tests of vibration sensitivity and temperature increase. In each experiment, the number of flies affected by seizures, the latency time, the duration of seizures and the recovery period were measured for both groups. In addition, we use flies with the mutation gish04895 or with RNAi for this gene as positive control, because it is a known suppressor of the parabss1 phenotype.

The vibration test was very useful to find the potential genetic modifiers. However, the temperature test was not so successful, given that, more than a half of the flies showed no change in its behaviour. This fact, suggested us that this experiment is not the most decisive for our objective and, therefore, the data obtained, although showing certain trends, are not conclusive.

The results in the vibration assay showed that six of the evaluated genes had a partial suppressor profile of the epileptic phenotype (nAchR¿1, CG8916, Clc-a, Ca-ß, pdp1 and Ca-¿1T) and two genes were enhancers (Sh and KCNQ). However, four groups of control flies (Slo, nAchR¿4, Lcch3 and cac) failed and, therefore, the obtained data are not reliable. In addition, the Toy gene could not be evaluated in the experiments, although it was possible to obtain daughters with the desired phenotype, they died early without being able to be replaced.

After the data analysis, we conclude that three possible new suppressor genes and two enhancers were identified. The potential suppressors are nAchR¿1, CG8916 and Clc-a, being the first two, those who showed an important improvement in the number of flies affected, in the duration of the seizure and recovery time. The intensifiers could be Sh and KCNQ. Sh was the gene that showed a clearer profile with a significant increase in the number of flies with seizures and with a longer duration of them.

Finally, although our experiments present interesting results, it is necessary, in the future, to expand our research by making new tests with flies and other vertebrate animal models that allow us to confirm with certainty the findings obtained (including electrophysiological studies). In addition, it would be important to identify the contribution of each modifying gene in the pathophysiology of Dravet Syndrome,