IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MUTANTES DE TOMATE RELACIONADOS CON EL CUAJADO DEPENDIENTE E INDEPENDIENTE DE POLINIZACIÓN

Abstract

La tasa de cuajado es un factor determinante en la producción de un cultivar. Este proceso, regulado en gran medida por señales hormonales, representa la primera etapa del desarrollo de un fruto y depende del éxito de la polinización y de la fecundación. A pesar de su importancia agronómica, los mecanismos moleculares que regulan el proceso del cuajado del fruto son aún desconocidos. La identificación y caracterización de mutantes afectados en la tasa de cuajado es una de las mejores estrategias para lograr este propósito. En este trabajo de investigación hemos abordado la caracterización de tres mutantes insercionales de tomate afectados en la tasa de cuajado de fruto. Dos de estos mutantes, Lower fruit setting 2084 y 2448 (Lfs2084 y Lfs2448), identificados en el contexto de esta Tesis Doctoral, exhiben menor tasa de cuajado de fruto y presentan un patrón de herencia autosómica dominante. La caracterización de ambas mutaciones ha permitido descubrir que están asociadas a un fenómeno de letalidad del gameto masculino. La mutación Lfs2084 promueve la degeneración de los granos de polen que portan el inserto, pero también afecta al desarrollo reproductivo del ovario, lo que reduce de forma dramática la tasa de cuajado de fruto. El análisis del contenido endógeno de hormonas de este mutante parece indicar una alteración de la ruta del 2C-metil-Deritrol 4-fosfato (MEP), responsable de la síntesis de fitohormonas, pigmentos fotosintéticos y moléculas de defensa. Los menores contenidos de GA1 en Lfs2084, la giberelina activa más importante en el inicio del desarrollo del fruto de tomate, podrían estar asociados con una mayor actividad del enzima catabólico SlGA2ox2. Estos resultados, junto con los cambios en los perfiles de expresión de SlARF7 y TAG1, son coherentes con el fenotipo de menor tasa de cuajado observado en el mutante. La mutación Lfs2448 también promueve la degeneración de los granos de polen portadores del inserto, reduciendo en gran medida la cantidad de tubos polínicos que progresan a lo largo del estilo durante el proceso de polinización. Su caracterización molecular ha indicado que el fenotipo de Lfs2448 podría estar ocasionado por la alteración de la función de uno o dos genes que codifican proteínas CYP450 y que se expresan mayoritariamente en botones florales y frutos de 1 cm. Los resultados sugieren que la mutación desempeña un relevante papel en el desarrollo reproductivo de tomate, afectando al proceso de polinización y al cuajado de fruto. Además, la caracterización del mutante Arlequín (Alq) ha revelado alteraciones en su programa de desarrollo vegetativo y reproductivo. Respecto al desarrollo vegetativo, Alq promueve un patrón de crecimiento más vigoroso que el que exhiben las líneas hermanas que carecen de la mutación, así como cambios en la configuración espacial del desarrollo radicular. Con relación al desarrollo reproductivo, Alq conduce a un mayor cuajado de fruto como consecuencia de eventos de división celular en el pericarpio del ovario previos al proceso de polinización. Un aspecto esencial desde un punto de vista agronómico es que la mayor tasa de cuajado permite que Alq mantenga la producción de fruto en condiciones de moderada salinidad.

Fruit setting rate is one of the most determining factors in the yield of a cultivar. This process, largely regulated by hormonal signals, is the first stage of fruit development and depends on the successful completion of pollination and fertilization. Despite their agronomic importance, the molecular mechanisms regulating the fruit setting process are still unknown. The identification and characterization of mutations affecting fruit set rate is one of the best strategies to achieve this purpose. In this research work the characterization of three tomato insertional mutants altered in the fruit set rate has been addressed. Two of these mutants, Lower fruit setting 2084 y 2448 (Lfs2084 and Lfs2448), identified in the context of this Doctoral Thesis, exhibit decreased fruit set rate and present an autosomal dominant inheritance pattern. The characterization of both mutations allowed us to discover that they are associated with a phenomenon of lethality of the male gametes carrying the T-DNA insert. The Lfs2084 mutation not only promotes degeneration of pollen grains bearing the T-DNA, but also affects the reproductive development of the ovary, dramatically reducing the fruit set rate. Analysis of the endogenous hormone content of this mutant suggests an alteration of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway, responsible for the synthesis of phytohormones, photosynthetic pigments and plant defence molecules. The lower GA1 content in Lfs2084 mutant, the main active form to induce fruit development, may be associated with increased activity of the SlGA2ox2 catabolic enzyme. These results, together with the changes in the expression profiles of both SlARF7 and TAG1 genes, are consistent with the phenotype of lower fruit set rate. The Lfs2448 mutation also promotes degeneration of the pollen grains carrying the T-DNA, largely reducing the number of pollen tubes that progress along the style during the pollination process. Its molecular characterization indicated that the Lfs2448 mutant phenotype could be caused by the functional alteration of one or two genes that encode CYP450 proteins mostly expressed in floral buds and young fruits. Results suggest that the tagged gene plays an important role in tomato reproductive development, affecting both normal pollination and fruit set process. Furthermore, the characterization of the Arlequín (Alq) mutant revealed alterations in its vegetative and reproductive developmental program. As regards vegetative development, Alq mutation promotes a more vigorous growth pattern, as well as changes in the spatial configuration of root system. Regarding reproductive development, Alq mutation leads to increased fruit set as a consequence of cell division events in the ovary pericarp prior to the pollination process. Finally, it should be noted that, thanks to its higher fruit set rate, the Arlequin mutant is capable of maintaining fruit production in moderate salinity conditions, which is of great importance from an agronomic point of view.

La taxa de quallat és un factor determinant en la producció d`un cultivar. Aquest procés, regulat en gran mesura per senyals hormonals, representa la primera etapa del desenvolupament d¿un fruit i depén de l¿èxit de la pol·linització i de la fecundació. A pesar de la seua importància agronòmica, els mecanismes moleculars que regulen el procés de quallat són encara desconeguts. La identificació i caracterització de mutants afectats en la taxa de quallat és una de les millors estratègies per aconseguir aquest propòsit. En aquest treball d¿investigació hem abordat la caracterització de tres mutants insercionals de tomaca afectats en la taxa de quallat de fruit. Dos d¿aquests mutants, Lower fruit setting 2084 i 2448 (Lfs2084 i Lfs2448), identificats en el context d¿aquesta Tesi Doctoral, exhibixen una menor taxa de quallat de fruit i presenten un patró d¿herència autosòmica dominant. La caracterització d¿ambdós mutacions ha permés descobrir que es troben associades a un fenomen de letalitat del gàmeta masculí. La mutació Lfs2084 promou la degeneració dels grans de pol·len que porten l¿insert, però també afecta el desenvolupament reproductiu de l¿ovari, la qual cosa reduïx de forma dramàtica la taxa de quallat de fruit. L¿anàl·lisi del contingut endogen d¿hormones d¿aquest mutant pareix indicar una alteració de la ruta 2C-metil-Deritrol 4-fosfato (MEP), responsable de la síntesi de fitohormones, pigments fotosintètics i molècules de defensa. Els menors continguts de GA1 en Lfs2084, la gibberel·lina activa més important a l'inici del desenvolupament del fruit de tomaca, podrien estar associats amb una major activitat de l¿enzim catabòlic SlGA2ox2. Aquests resultats, juntament amb els canvis en els perfils d¿expressió de SlARF7 i TAG1, són coherents amb el fenotip de menor taxa de quallat observat en el mutant. La mutació Lfs2448 també promou la degeneració dels grans de pol·len portadors de l¿insert, reduint en gran mesura la quantitat de tubs pol·línics que progressen al llarg de l¿estil durant el procés de pol·linització. La seua caracterització molecular ha indicat que el fenotip de Lfs2448 podria estar ocasionat per una alteració de la funció d¿un o dos gens que codifiquen proteïnes CYP450 i que s'expressen majoritàriament en botons florals i fruits d¿un centímetre. Els resultats suggerixen que la mutació té una funció important en el desenvolupament reproductiu de la tomaca, afectant el procés normal de pol·linització i el quallat de fruit. A més, la caracterització del mutant Arlequín (Alq) ha revelat alteracions en el seu programa de desenvolupament vegetatiu i reproductiu. Pel que fa al desenvolupament vegetatiu, Alq promou un patró d¿expressió més vigorós que el que exhibixen les línies germanes que no porten la mutació, així com canvis en la configuració espacial del desenvolupament radicular. Quant al desenvolupament reproductiu, Alq conduïx a un major quallat de fruit com a conseqüència d¿events de divisió cel·lulars en el pericarp de l¿ovari previs al procés de pol·linització. Un aspecte essencial des d¿un punt de vista agronòmic és que la major taxa de quallat pemet que Alq mantinga la producció de fruit en condicions de moderada salinitat.