Producción y utilización Biotecnológica de nuevas proteínas antifúngicas de hongos filamentosos

Abstract

[ES] Los péptidos antimicrobianos (AMP) son una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos antifúngicos que puedan sustituir a los fungicidas usados en agricultura. Sin embargo, el alto coste de la síntesis química y la dificultad para su producción a gran escala han limitado su aplicación. Las proteínas antifúngicas (AFP) son AMP naturales, pequeñas, catiónicas, secretadas y ricas en cisteína con gran potencial para el control de hongos fitopatógenos. Las AFPs se encuentran en hongos filamentosos, son estables y pueden producirse en grandes cantidades. Sin embargo, el papel biológico en su hongo productor no se conoce en profundidad. En esta tesis, se estudió la diversidad de AFPs en genomas de hongos ascomicetos y se propuso una nueva clasificación en tres clases (A, B y C). Penicillium digitatum es el principal patógeno postcosecha de cítricos y codifica solo una AFP en su genoma de clase B (AfpB), mientras que Penicillium expansum, el principal patógeno postcosecha de manzana, codifica una AFP de cada clase (AfpA, AfpB y AfpC). En este trabajo describimos la producción biotecnológica y la caracterización de estas cuatro AFPs. Se ha caracterizado el papel biológico del gen afpB en P. digitatum mediante estudios de expresión génica y generación de mutantes nulos y de expresión constitutiva. Los resultados indicaron que afpB es prescindible para la biología y el ciclo vital del hongo, aunque la expresión del gen afpB bajo el promotor constitutivo gpdA de Aspergillus nidulans es perjudicial para su crecimiento y virulencia. Sorprendentemente, ni la cepa parental ni las cepas constitutivas produjeron cantidades detectables de AfpB a pesar de la alta expresión del gen codificante. El modelado molecular y el diseño racional permitieron predecir la estructura terciaria de AfpB y diseñar péptidos sintéticos para mapear motivos antifúngicos en su secuencia primaria. Confirmamos que los bucles catiónicos L2 y L3 mostraron actividad antifúngica moderada y que pueden actuar sinergísticamente. Con el objetivo de producir AfpB mediante biotecnología, usamos un casete de expresión de AFPs basado en las regiones promotora y terminadora del gen paf de Penicillium chrysogenum, hongo que produce naturalmente grandes cantidades de su propia proteína PAF. Este casete funcionó en P. digitatum y permitió la producción homóloga de AfpB. Los datos también mostraron que las secuencias del péptido señal (SP) y el pro-péptido de la SP-Pro-AfpB no determinan la producción de proteína. También demostramos la estabilidad térmica y la resistencia a la proteólisis de AfpB, y aportamos datos que sugieren que la estructura terciaria no es necesaria para la actividad antifúngica. Similar a lo descrito en P. digitatum, ninguna de las tres AFPs se detectó en los sobrenadantes de cultivo en medio rico de P. expansum. Sin embargo, AfpA se produjo en grandes cantidades en cultivos de medio mínimo de P. expansum. Para completar el repertorio de AFPs, produjimos las tres AFPs de P. expansum (AfpA, AfpB y AfpC) en P. chrysogenum con el casete paf. Las tres proteínas de P. expansum se produjeron, purificaron y caracterizaron con éxito. Ninguna de las AFPs producidas en este trabajo fue citotóxica frente a eritrocitos de mamíferos. AfpA de P. expansum seguida de AfpB de P. digitatum fueron las AFPs más activas contra hongos filamentosos, incluyendo patógenos de plantas y humanos, productores de micotoxinas y sus propios hongos productores, una característica previamente no descrita en las AFPs. Además, la AfpA de P. expansum y la AfpB de P. digitatum protegieron frente a la infección causada por el hongo Botrytis cinerea en plantas de tomate, y AfpA de P. expansum protegió frente a P. digitatum en frutos de naranja. Estos resultados confirman nuestra hipótesis de que las AFPs son buenas candidatas para el desarrollo de nuevos antifúngicos en protección vegetal y conservación postcosecha, pero ta

[CA] Els pèptids antimicrobians (AMP) són una alternativa prometedora per al desenvolupament de nous antifúngics que puguen substituir als fungicides utilitzats en agricultura. No obstant això, l'alt cost de la síntesi química i la dificultat per a la producció biotecnològica a gran escala han limitat la seua aplicació. Les proteïnes antifúngiques (AFP) són AMPs naturals, xicotetes, catiòniques, secretades i riques en cisteína que oferixen un gran potencial per al control de fongs fitopatogens. Les AFPs estan presents de en fongs filamentosos, són molt estables i poden produir-se en grans quantitats. No obstant això, el paper biològic d'estes AFPs en el seu fong productor encara no està clar. En esta tesi es va estudiar la diversitat d'AFPs en genomes de fongs ascomicets i es va proposar una nova classificació en tres clases (A, B i C). Penicillium digitatum, el principal patogen postcollita de cítrics, codifica només una AFP en el seu genoma de classe B (AfpB). Penicillium expansum, el principal patogen postcollita de poma, codifica una AFP de cada classe (AfpA, AfpB i AfpC). En este treball presentem la producció biotecnològica i la caracterització d'estes quatre AFPs. Hem caracteritzat el paper biològic del gen afpB en P. digitatum mitjançant estudis d'expressió gènica i la generació de mutants nuls i d'expressió constitutiva. Els resultats van indicar que afpB és prescindible per a la biologia i el cicle de vida d'este fong, encara que l'expressió del gen afpB davall el promotor constitutiu gpdA d'Aspergillus nidulans és perjudicial per al seu creixement i virulència sobre fruits cítrics. Sorprenentment, ni el cep parental ni els ceps constitutius van produir quantitats detectables d'AfpB malgrat l'alta expressió del gen afpB. El modelatge molecular i el disseny racional van permetre predir l'estructura terciària d'AfpB i dissenyar pèptids sintètics per a identificar motius antifúngics dins de la seqüència primària. Confirmarem que les estructures catiòniques L2 i L3 mostren activitat antifúngica i que poden actuar de forma sinèrgica. Amb l'objectiu de la producció biotecnològica d'AfpB, utilitzarem un casset d'expressió d'AFPs basat en les regions promotora i terminadora del gen paf de Penicillium chrysogenum, el qual produïx naturalment grans quantitats de la seua pròpia proteïna PAF. Este casset va funcionar en P. digitatum i va permetre la producció homòloga d'AfpB. Les dades també van mostrar que les seqüències del pèptid señal (SP) i el propèptid de la SP-Pro-AfpB no determinaren la producció de proteïna. També demostrarem l'extrema estabilitat tèrmica i la resistència proteolítica d'AfpB, i proporcionem dades que suggerixen que l'estructura terciària no és necessària per a l'activitat antifúngica. Semblant a P. digitatum, cap de les tres AFPs es van detectar en els sobrenadants de medi de cultiu ric de P. expansum. Al contrari, AfpA es va produir en grans quantitats en cultius de P. expansum en medi mínim. Per a completar el repertori d'AFPs, vam produir les tres AFPs de P. expansum (AfpA, AfpB i AfpC) en P. chrysogenum mitjançant l'ús del casset paf. Així, les tres proteïnes de P. expansum es van produir, purificar i caracteritzar amb èxit. Cap de les AFPs produïdes en este treball va ser citotóxica front eritròcits de mamífer. AfpA de P. expansum seguida d'AfpB de P. digitatum van ser les AFPs més actives contra fongs filamentosos, incloent patògens de plantes i humans, productors de micotoxines i els seus propis productors, una característica prèviament no descrita per a les AFPs. A més, AfpA de P. expansum i AfpB de P. digitatum van protegir front la infecció causada pel fong Botrytis cinerea en plantes de tomaca, i l'AfpA de P. expansum va protegir front P. digitatum en fruits de taronja. Estos resultats confirmen la nostra hipòtesi anterior de que les AFPs són bones candidates per al desenvolupament d'antifúngics en protecció

[EN] Antimicrobial peptides (AMPs) are promising antifungal alternatives to the fungicides used in agriculture. However, the high cost of chemical synthesis and the difficulties of large-scale production have limited their application. Antifungal proteins (AFPs) are a group of natural, small, cationic, secreted, cysteine-rich AMPs that offer a great potential to develop new biomolecules for the control of phytopathogenic fungi. AFPs are naturally present in filamentous fungi, are very stable, and can be produced in large amounts. However, the biological role of these AFPs in their producer fungus is still unclear. In this thesis, we first studied the diversity of AFPs in ascomycetous genomes and proposed a new classification in three different classes (A, B and C). Penicillium digitatum is the main citrus postharvest pathogen and encodes only one AFP from class B in its genome (AfpB), while Penicillium expansum is the main pome postharvest pathogen and encodes one AFP from each class (AfpA, AfpB and AfpC). In this work, we report the identification, efficient biotechnological production and characterization of these four AFPs. We characterized the biological role of the afpB gene in P. digitatum by the study of its gene expression pattern and the generation of null and constitutive expression mutants. Results indicated that afpB is dispensable for the biology and life cycle of this fungus, although expression of the afpB gene under the constitutive Aspergillus nidulans gpdA promoter is detrimental to growth and virulence to citrus. Surprisingly, neither the wild type nor the constitutive strains produced detectable amounts of AfpB in spite of the high afpB gene expression. Molecular modeling and rational design allowed us to predict the AfpB tertiary structure and design synthetic peptides to map antifungal motifs within the AfpB primary sequence. We confirmed that the cationic exposed loops L2 and L3 showed moderate antifungal activity and that they can act synergistically. With the objective of the biotechnological production of AfpB, we used an AFP expression cassette based on the promoter and terminator regions of the well-studied paf gene from Penicillium chrysogenum, which naturally produces high amounts of its own protein PAF. This paf cassette worked efficiently in P. digitatum and allowed the homologous production of AfpB. Data also showed that the signal peptide (SP) and pro-peptide sequences of the translated SP-Pro-AfpB do not determine protein production. We also demonstrated the thermal stability and resistance to proteolytic cleavage of the P. digitatum AfpB, and provided data that suggest that tertiary structure is not required for antifungal activity. Similar to P. digitatum, none of the three AFPs were detected in supernatants of cultures of P. expansum in rich medium. By contrast, AfpA was produced with very high yields in P. expansum cultures in minimal medium. To complete the repertoire of AFPs from P. expansum we produced the three AFPs from P. expansum (AfpA, AfpB and AfpC) in P. chrysogenum with the use of the paf cassette. With this combined approach, the three P. expansum proteins were successfully produced, purified and characterized. None of the four AFPs produced in this work were cytotoxic against mammal erythrocytes. The P. expansum AfpA followed by the P. digitatum AfpB were the most active AFPs against filamentous fungi, including plant and human pathogens, mycotoxin-producer fungi, and their own producers, a feature that had not been previously described for AFPs. Moreover, AfpA from P. expansum and AfpB from P. digitatum protected against fungal infection caused by Botrytis cinerea in tomato plants, and additionally the P. expansum AfpA protected against P. digitatum in orange fruits. These results confirm our previous hypothesis that AFPs are good candidates for the development of antifungals in plant protection and postharvest conservation, but also in clinic or food preservation.