Interacción entre las vías HIF, Notch y SUMO y su implicación en la biología de las hMSCs

Abstract

En las últimas décadas, las células troncales o células madre han generado un gran interés en diversas áreas de la medicina y la investigación biomédica, sobre todo en campos como la regeneración y terapia celular. Las células mesenquimales estromales, pertenecientes al tipo de células madre adultas, están en el punto de mira en este campo debido a sus características biológicas favorables como su multipotencia, efecto paracrino, propiedades inmunomoduladoras, conducta migratoria, así como a la ausencia de connotaciones ético-morales. Uno de los problemas principales del mantenimiento de las células madre en cultivo es la rapidez con la que estas células se vuelven senescentes, habiéndose demostrado que cultivar estas células en condiciones de hipoxia favorece el mantenimiento de las características primordiales de las células madre. La habilidad de percibir y responder a cambios en la concentración de oxígeno es una propiedad fundamental de las células eucariotas. Dicha propiedad conduce a la adaptación del metabolismo celular y a la regulación de la transcripción génica mediante los factores inducibles por hipoxia (HIF), siendo el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) el mecanismo molecular mejor descrito para el mantenimiento de la homeostasis del oxígeno. Por otra parte, una de las principales vías implicadas en el mantenimiento del estado indiferenciado de las células madre es la vía de Notch, que modula la transcripción en diversos tipos celulares, vinculando la decisión del destino celular de una célula a la de la célula vecina. Los efectos de Notch en el mantenimiento de la indiferenciación celular o en la iniciación de la diferenciación son dependientes de ambiente y tiempo, garantizando así un equilibrio adecuado entre las células madre y su progenie, interfiriendo o favoreciendo el compromiso celular. Numerosos artículos relacionan las vías HIF y Notch, pero todavía permanecen por esclarecer diversos puntos de la interacción entre ambas vías. La SUMOilación es una modificación postraduccional mediante la cual se une de manera covalente la pequeña proteína SUMO (Small Ubiquitin-related modifiers) a otras proteínas. Las consecuencias de la SUMOilación son diversas y dependen de la proteína que ha sido modificada. Las funciones que se ven alteradas mediante esta modificación son la transcripción, la proliferación, la reparación del ADN y la localización nuclear entre otras. Dada la relación ya descrita entre la hipoxia y la modificación postraduccional SUMO surge este trabajo, donde se describe la interacción entre las vías de HIF, Notch y SUMO. A lo largo de este estudio, hemos relacionado la estabilización de HIF-1¿ con el incremento directo de los niveles generales de SUMO1 y con la consecuente SUMOilación de las proteínas. Entre la SUMOilación de diferentes proteínas incluimos el dominio intracelular de Notch 1 (N1ICD), modificación no descrita hasta el momento. En la presente tesis, esclarecemos los mecanismos de interacción entre estas tres vías altamente conservadas en eucariotas y describimos los sitios clave de SUMOilación de N1ICD. Por otra parte, dilucidamos cómo esta interacción modula el comportamiento de las células mesenquimales estromales con el fin de poder mejorar sus propiedades en vistas a su uso terapéutico.

En les últimes dècades, les cèl·lules troncals o cèl·lules mare han generat un gran interès en diverses àrees de la medicina i la investigació biomèdica, sobretot en camps com la regeneració i teràpia cel·lular. Les cèl·lules mesenquimals estromals, pertanyents al tipus de cèl·lules mare adultes, estan en el punt de mira en aquest camp per les seves característiques biològiques favorables con la multipotencia, efecte paracrí, propietats immunomoduladores, conducta migratòria així com a l'absència de connotacions ètic-morals. Un dels principals problemes del manteniment de les cèl·lules mare en cultiu és la rapidesa amb la qual aquestes cèl·lules es tornen senescents, havent-se demostrat que cultivar aquestes cèl·lules en condicions d'hipòxia afavoreix el manteniment de les característiques primordials de les cèl·lules mare. L'habilitat de percebre i respondre a canvis en la concentració d'oxigen és una propietat fonamental de les cèl·lules eucariotes. Aquesta propietat condueix a l'adaptació del metabolisme cel·lular i a la regulació de la transcripció gènica mitjançant els factors induïbles per hipòxia (HIF), sent el factor induïble per hipòxia 1 (HIF-1) el mecanisme molecular millor descrit per al manteniment de l'homeòstasi de l'oxigen. D'altra banda, una de les vies implicades en el manteniment de l'estat indiferenciat de les cèl·lules mare és la via de Notch, que modula la transcripció en diversos tipus cel·lulars, vinculant la decisió del destí cel·lular d'una cèl·lula a la de la cèl·lula veïna. Els efectes de Notch en el manteniment de la indiferenciació cel·lular o en la iniciació de la diferenciació són dependents d'ambient i temps, garantint així un equilibri adequat entre les cèl·lules mare i la seva progènie, interferint o afavorint el compromís cel·lular. Nombrosos articles relacionen les vies HIF i Notch, però encara romanen per aclarir diversos punts de la interacció entre les dos vies. La SUMOilació és una modificació postraduccional mitjançant la qual s'uneix de manera covalent la proteïnaSUMO (Small ubiquitin-related modifiers) a altres proteïnes. Les conseqüències de la SUMOilació són diverses i depenen de la proteína que ha estat modificada. Les funcions que es veuen alterades mitjançant aquesta modificació són la transcripció, la proliferació, la reparació de l'ADN i la localització nuclear entre d'altres. Donada la relació ja descrita entre la hipòxia i la modificació postraduccional SUMO sorgeix aquest treball, on es descriu la interacció entre les vies de HIF, Notch i SUMO. Al llarg d'aquest estudi, hem relacionat l'estabilització d'HIF-1¿ l'increment directe dels nivells generals de SUMO1 i amb la conseqüent SUMOilació de diferentes proteïnes. Entre la SUMOilació de diferents proteïnes incloem el domini intracel·lular de Notch 1 (N1ICD), modificació no descrita fins al moment. En la present tesi, aclarim els mecanismes d'interacció entre aquestes tres vies altament conservades en eucariotes i descrivim els llocs clau de SUMOilació de N1ICD. D'altra banda dilucidem com aquesta interacció modula el comportament de les cèl·lules mesenquimals estromals per tal de poder millorar les seves propietats en vistes al seu ús terapèutic.

In the past few decades, stem cells have generated great interest in different areas of medicine and biomedical research, especially in fields such as regenerative medicine and cell therapy. Mesenchymal stromal cells, belonging to the group of adult stem cells, are in the spotlight in this field due to their favorable biological characteristics, as well as multipotence, paracrine effects, immunomodulatory properties, migratory behavior or the absence of ethical-moral connotations. One of the main problems of the maintenance of the stem cells in culture is that these cells become senescent in few passages. Our group and others have been shown that culture mesenchymal stromal cells as well as other kind of stem cells under hypoxic conditions, favors the maintenance of the main characteristics of the stem cells. The ability to perceive and respond to changes in oxygen concentration is a fundamental property of eukaryotic cells. This property leads to the adaptation of cellular metabolism and the regulation of gene transcription by hypoxia-inducible factors (HIF), being the hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) the best-described molecular mechanism to maintain oxygen homeostasis. In addition, one of the pathways involved in maintaining the undifferentiated state of stem cells is the Notch pathway., that modulates transcription of a wide variety of cell types linking the fate of neighboring cells. Effects of Notch in the maintenance of stem properties or initiation of differentiation is environment and time dependent, thus ensures a proper balance between stem cells and their progeny, interfering or promoting cell commitment. Currently, there are articles in which the HIF and Notch pathways are related, but several points of this interaction between both pathways still remain to be clarified. SUMOylation is a postranslational modification where a small protein called SUMO (Small Ubiquitin-related modifiers) are covalently bound to other proteins. The several consequences of SUMOylation depend on the protein that has been modified. The functions that are altered by this modification include transcription, proliferation, DNA repair and nuclear localization among others. Given the already described relationship between hypoxia and the postranslational modification SUMO, this work emerges, where the interaction between the HIF, Notch and SUMO pathways is described. Throughout this study, we have been related the stabilization of HIF-1¿ with the direct increase of the general levels of SUMO1 and with the consequent protein SUMOylation including the intracellular domain of Notch 1 (N1ICD), modification not described until now. In the present thesis, we clarify the mechanisms of interaction between these three highly conserved pathways in eukaryotes and described the key SUMOylation sites of N1ICD. Furthermore, we elucidate how this interaction modulates the behavior of mesenchymal stromal cells in order to improve their properties in view of a therapeutic use.