Análisis funcional y aplicaciones biotecnológicas del promotor del gen END1 de guisante (Pisum sativum L.)

Abstract

[EN] END1 is an anther-specific gene of pea (Pisum sativum. L) that displays specific expression in the cell lines that will develop the epidermis, connective, middlle layer and endothecium tissues from very early stages (anther primordium) to late stages of the anther development. The END1 promoter region drives the uidA (GUS) gene expression specifically to the anthers of Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum and Lycopersicon esculentum. The chimaeric END1::GUS gene is regulated exactly like the endogenous END1. The spatial and temporal expression pattern of END1 and the functionality of its promoter region in different plant species suggested us the possibility to use its promoter region for biotechnological applications. We fused the 2’7 kb END1 5’ region with the ribonuclease barnase gene. The barnase is a natural ribonuclease isolated from Bacillus amyloliquefaciens. The chimaeric END1::barnasa gene was introduced into Arabidopsis, tobacco and tomato plants. The expression of the chimaeric gene inhibited anther morphogenesis and efficiently produced male-sterile transgenic plants. A detailed histological study of the development of both, WT and transgenic anthers, showed severe morphological differences from very early stages of anther development. The effects of barnase in transgenic anthers appeared when the anther was at the stage of anther primordium and it was composed by undifferentiated cells. Our results show that the END1 promoter might be a biotechnological tool to generate male-sterile plants for the production of hybrid crop plants. Tomato male-sterile transgenic plants produced parthenocarpic fruits. This observation suggests that male-sterility in tomato is related to the induction of parthenocarpic fruits. To identify and characterize cis-regulatory elements involved in the promoter strength and specificity, expression analysis were performed using constructs containing the END1 promoter, modified by deleting different nucleotide sequences, and the β-glucuronidase gene. Our results reveal that the 5’ region -336/-6 is sufficient to direct properly the spatial and temporal END1 gene expression and also, suggest that the END1 might be a target gene of floral organ identity genes of classes B and C.

[ES] END1 es un gen de guisante (Pisum sativum L.) específico de antera que comienza a expresarse desde estadios tempranos del desarrollo (primordio de antera) en aquellas líneas celulares que darán lugar a los tejidos epidermis, conectivo, capa intermedia y endotecio, y en estos tejidos una vez desarrollados. La región promotora de dicho gen es capaz de dirigir la expresión específica del gen uidA (GUS) a las anteras de plantas de diferentes especies (Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum y Lycopersicon esculentum). El patrón de expresión del gen GUS en esas plantas es similar al del gen END1 en guisante. Esta especificidad que confiere el promotor de END1 para la expresión de un gen foráneo en las anteras ofrecía la posibilidad de utilizarlo, fusionándolo a un gen citotóxico, como una herramienta biotecnológica para la obtención de plantas transgénicas androestériles. En este trabajo, hemos fusionado la región 5’ completa (-2736/-6) del promotor de END1 a la secuencia codificante de la ribonucleasa extracelular producida por el Bacillus amyloliquefaciens, barnasa. Con esta construcción hemos transformado dos plantas modelo, Arabidopsis y tabaco y una planta de interés agronómico, el tomate. La expresión del gen citotóxico barnasa donde END1 es activo, trajo como consecuencia una degeneración de tejidos de la antera que inhibió el desarrollo de los granos de polen. Las plantas transgénicas resultantes fueron androestériles. Los estudios a nivel histológico de las anteras transgénicas mostraron que los efectos de la barnasa comienzan a observarse muy pronto en el primordio de antera, cuando este está constituido sólo por células indiferenciadas, y continúa observándose a lo largo del desarrollo de la misma. De manera general, al final del programa de desarrollo, las anteras transgénicas eran de menor tamaño, su morfología era distinta de las de las anteras silvestres correspondientes, y en su interior se observaba el tejido conectivo colapsado y una estructura amorfa en lugar de granos de polen viable. La posible pérdida de las células parietales primarias por la acción ribonucleasa podría estar afectando la diferenciación de las células esporógenas, contiguas en el territorio del futuro microsporangio. Estos resultados muestran que el promotor de END1 podría ser una herramienta biotecnológica útil en los programas de obtención de semillas híbridas de diferentes cultivos de interés agronómico. En el caso particular del tomate, todas las plantas transgénicas androestériles produjeron frutos partenocárpicos. Este resultado muestra que existe una relación entre la androesterilidad y el desarrollo autónomo del ovario en esa especie. Por otra parte, se ha realizado un análisis del promotor del gen END1. Para este análisis se realizaron delecciones sucesivas de la región 5’ del gen y los fragmentos resultantes se fusionaron transcripcionalmente al gen delator uidA (GUS). Con estas construcciones se transformaron plantas de A. thaliana y se estudió la expresión del gen uidA mediante el ensayo histoquímico de la actividad de la β-glucuronidasa. Hemos visto que el fragmento de 366/-6 de la región 5’ es la secuencia mínima con capacidad para dirigir la correcta expresión espacial y temporal del gen END1. La pérdida de la expresión de GUS en las anteras de las plantas de Arabidopsis thaliana transformadas con el fragmento de la región 5’ donde se elimina el motivo CArG2, apoya la hipótesis de que END1 podría estar regulado directamente por los genes de identidad de órgano de clase B y C.

[CA] END 1 és un gen de pèsol (Pisum sativum L.) específic d'antera que comença a expressar-se des d'estadis primerencs del desenvolupament (primordi d'antera) en aquelles línies cel·lulars que donaran lloc als teixits epidèrmics, connectiu, capa intermèdia i endoteci, i en aquests teixits una vegada desenvolupats. La regió promotora d'aquest gen és capaç de dirigir l'expressió específica del gen uidA (GUS) a les anteres de plantes de diferents espècies (Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum i Lycopersicon esculentum). El patró d'expressió del gen GUS en aquestes plantes és similar al del gen END1 en pèsol. Aquesta especificitat que confereix el promotor d' END 1 per a l'expressió d'un gen forà les anteres oferia la possibilitat d'utilitzar-lo, fusionant-lo a un gen citotòxic, com una ferramenta biotecnològica per a l'obtenció de plantes transgèniques androestèrils. En aquest treball, hem fusionat la regió 5' completa (-2736/-6) del promotor d' END1 a la seqüència codificant de la ribonucleasa extracel·lular produïda per Bacillus amyloliquefaciens, barnasa. Amb aquesta construcció hem transformat dos plantes model, Arabidopsis i tabac i una planta d'interés agronòmic, la tomata. L'expressió del gen citotòxic barnasa a on END1 és actiu, porta com a conseqüència una degeneració de teixits de l'antera que va inhibir el desenvolupament dels grans de pol·len. Les plantes transgèniques resultants foren androestèrils. Els estudis a nivell histològic de les anteres transgèniques mostraren que els efectes de la barnasa comencen a observar-se molt prompte en el primordi d'antera, quant aquest está constituït només per cèl·lules indiferenciades, i continua observant-se al llarg del desenvolupament de la mateixa. De forma general, al final del programa de desenvolupament, les anteres transgèniques eren de menor mida , la seua morfologia era diferent de la de les anteres silvestres corresponents , i al seu interior s'observava el teixit connectiu col lapsat i una estructura amorfa en lloc de grans de pol·len viable. La possible pèrdua de les cèl·lules parietals primàries per l'acció ribonucleasa podria estar afectant la diferenciació de les cèl·lules esporògenes,contigües en el territori del futur microesporangi. Aquests resultats mostren que el promotor d' END1 podria ser una ferramenta biotecnològica útil en els programes d'obtenció de llavors híbrides de diferents cultius d'interès agronòmic. En el cas particular de la tomata, totes les plantes transgèniques androestèrils produïren fruits partenocàrpics. Aquestresultat mostra que existeix una relació entre l'androstèrilitat i el desenvolupament atònom de l'ovari en eixa espècie. D' altra banda, s' ha realitzat una anàlisi del promotor del gen END1. Per a aquesta anàlisi és realitzaren delecions successives de la regió 5' del gen i els fragments resultants es fusionaren transcripcionalment al gen delator uidA (GUS). Amb estes construccions és transformaren plantes de A. thaliana i es va estudiar l'expressió del gen uidA mitjançant l'assaig histoquímic de l'activitat de la beta-glucuronidasa. Hem vist que el fragment de 366/-6 de la regió 5' ès la seqüència mínima amb capacitat per a dirigir la correcta expressió espacial i temporal de gen END1. La pèrdua de l'expressió de GUS en les anteres de les plantes d'Arabidopsis thaliana transformades amb el fragment de la regió 5' a on és elimina el motiu CArG2, recolza la hipòtesi que END1 podria estar regulat directament pels gens d'identitat d'òrgan de la classe B i C.