Disminución de los niveles de glutatión en células HeLa mediante tratamiento con diamida. Consecuencias epigenéticas y posibles implicaciones en patologías progeroides

Abstract

El glutatión (GSH) es el antioxidante no enzimático más abundante en las células de mamífero, constituido por un tripéptido glutamato-cisteína-glicina. Gracias al grupo sulfhidrilo de la cisteína, actúa como donador de electrones para reducir enlaces disulfuro entre cisteínas, reaccionar con especies reactivas de oxígeno mediante su grupo tiol oxidándose a glutatión disulfuro (GSSG)- o para convertir el peróxido de hidrógeno en dos moléculas de agua inocua para la célula mediante la acción de la enzima glutatión peroxidasa, entre otros antioxidantes enzimáticos. No obstante, en la actualidad se están estudiando otras funciones relacionadas con el GSH como es el caso de las modificaciones postraduccionales glutationilación de proteínas o su relación con la regulación epigenética, dado que algunas moléculas y metabolitos intermediarios de la síntesis de glutatión lo son a su vez de las rutas de metilación de ADN e histonas. Con la finalidad de analizar la relación entre el nivel de estado redox celular debido a niveles de GSH y la alteración de modificaciones postraduccionales en histonas, se ha optimizado un protocolo para disminuir la concentración de GSH celular mediante tratamiento con diamida en células HeLa, y se ha analizado mediante citometría de flujo, fluorimetría y microscopía de fluorescencia. En algunas patologías de carácter progeroide, caracterizadas por cursar con envejecimiento prematuro y en las que se ha observado alteraciones en la estructura de la cromatina, se ha comprobado que uno de los factores de relevancia es el estrés oxidativo que padecen a nivel celular, además de mostrar niveles disminuidos de GSH. Por esta razón, paralelamente se ha trabajado con líneas de fibroblastos humanos dos controles y un paciente de la patología progeroide síndrome de Werner analizando tanto enzimas antioxidantes, como modificaciones en histonas.

Glutathione (GSH) is the most abundant non-enzymatic antioxidant in mammalian cells, constituted by a glutamate-cysteine-glycine tripeptide. Thanks to its sulfhydryl residue, acts as an electron donor to reduce disulfide bonds between cysteines, to react with reactive oxygen species by means of its thiol group, or to convert hydrogen peroxide into two molecules of water -safe for the cell- through the action of the enzyme glutathione peroxidase, among other antioxidant enzymes. However, other functions related to GSH are currently being studied, as is the case of post-translational modifications protein glutathionylation- or its relation to epigenetic regulation, since some molecules and intermediate metabolites in the synthesis of glutathione are also involved in DNA and protein methylation pathways. In order to analyze the relationship between the cellular redox state due to GSH levels and alterations in histone posttranslational modifications, a treatment has been optimized to reduce cellular GSH concentration by treatment with diamide in HeLa cells, and the effect has been analyzed by flow cytometry, fluorimetry, and fluorescence microscopy. In some pathology with progeroid features, characterized by premature ageing and in which alterations in chromatin structure have been observed, it has been shown that one of the relevant factors is the oxidative stress they show at the cellular level, besides having reduced levels of GSH. For this reason, in parallel we have worked with human fibroblast cell lines two controls and a patient with Werner syndrome analyzing antioxidant enzymes and modifications in histones.