Estudio de la integridad del DNA libre circulante en orina como nuevo biomarcador de cánceres urológicos

Abstract

El cáncer representa la segunda causa de muerte en España, y un diagnóstico temprano está directamente relacionado con una mayor supervivencia. El cáncer renal es el décimo tumor más frecuente en España, y el único método diagnóstico disponible es el TAC, que implica una elevada radiación para el paciente (1 TAC = 500 radiografías de tórax). El cáncer vesical es el quinto tumor más frecuente en España y el octavo en número de fallecimientos, y el único método diagnóstico y de seguimiento disponible es la cistoscopia, método altamente invasivo. Cabe destacar que, a diferencia de otros tipos de tumores, en la actualidad todavía no disponemos de un método diagnóstico simple, mínimamente invasivo y económico para tumores como el cáncer renal y el vesical. Por ello, la biopsia líquida podría postularse como fuente de nuevos biomarcadores diagnósticos como el DNA libre circulante (cfDNA). El cfDNA en fluidos biológicos proviene de células que han muerto por apoptosis o necrosis. La necrosis conlleva una liberación incontrolada del contenido celular (DNA íntegro), mientras que la apoptosis es una muerte programada en la que el DNA nuclear sufre una fragmentación. Así, las células tumorales sufren necrosis y liberan el DNA íntegro mientras que las células no tumorales sufren apoptosis y liberan el DNA fragmentado. La integridad del DNA hace referencia a la distribución del tamaño de los fragmentos del DNA (grado de fragmentación) en una muestra biológica. Diversos estudios han demostrado que la integridad del DNA en sangre es un buen test diagnóstico para diversos tipos de cánceres, y la integridad del cfDNA en orina se ha propuesto como marcador de cáncer vesical, pero no hay estudios sobre el cáncer renal. Así, el objetivo de nuestro estudio es evaluar el potencial diagnóstico-pronóstico de cáncer renal y vesical del análisis de la integridad del cfDNA en orina. Para ello, evaluaremos el rendimiento de diversos kits de aislamiento de DNA y los modificaremos para maximizar el rendimiento y la pureza del DNA. Una vez seleccionado el mejor método, aislaremos el DNA de una colección de muestras de orina de pacientes con cáncer renal antes y después de operarse y de cáncer vesical infiltrante y no infiltrante, y de un grupo de individuos sanos (controles). Evaluaremos la integridad del DNA amplificando por PCR cuantitativa en tiempo real, amplificando fragmentos de diferentes tamaños (100-400 pb) calculando la concentración de cada amplicón interpolando en una recta patrón realizada a partir de DNA de aislado de cultivos celulares. Finalmente, compararemos las concentraciones de cada fragmento entre los diferentes grupos clínicos estudiados.

Cancer represents the second cause of death in Spain, and an early diagnosis is directly related to greater survival. Renal cancer is the most frequent tumor in Spain, and the only diagnostic method available is the TAC scan, which involves high radiation for the patient (1 TAC scan = 500 chest x-rays). Bladder cancer in the fifth most frequent tumor in Spain and the eighth in the number of deaths, and the only diagnostic and follow-up method available in cystoscopy, a highly invasive method. It should be noted that, unlike other types of tumors, we still do not have a simple, minimally invasive and economical diagnostic method for tumors such as renal and bladder cancer. Therefore, liquid biopsy could be postulated as a source of new diagnostic biomarkers such as circulating free DNA (cfDNA). The cfDNA in biological fluids comes from cells that have died from apoptosis or necrosis. Necrosis leads to uncontrolled release of cellular content (intact DNA), whereas apoptosis is a programmed death in which nuclear DNA undergoes fragmentation. Thus, the tumor cells undergo necrosis and release the whole DNA while the non-tumor cells undergo apoptosis and release the fragmented DNA. DNA integrity refers to the size distribution of DNA fragments (degree of fragmentation) in a biological sample. Several studies have shown that the integrity of DNA in blood is a good diagnostic test for various types of cancers, and the integrity of cfDNA in urine has been proposed as a marker for bladder cancer, but there are no studies on renal cancer. The aim of our study is to evaluate the diagnostic-prognostic potential of renal and bladder cancer of the analysis of the integrity of cfDNA in urine. To do this, we will evaluate the performance of various DNA isolation kits and modify them to maximize DNA yield and purity. Once the best method is selected, we will isolate the DNA from a collection of urine samples from patients with renal cancer before and after surgery and from infiltrating and noninvasive bladder cancer, and from a group of healthy individuals (controls). We will evaluate the integrity of the DNA amplifying by quantitative PCR in real time, amplifying fragments of different sizes (100-400 bp) calculating the concentration of each amplicon interpolating in a straight line made from DNA of cell culture isolate. Finally, we will compare the concentrations of each fragment among the different clinical groups studied.