La proteína kinasa SnRK2.7 inhibe el crecimiento y la actividad de la H+-ATPasa de la membrana plasmática de Arabidopsis en condiciones de frío

Abstract

[ES] La H+-ATPasa de la membrana plasmática es clave para el crecimiento de las plantas por generar un gradiente electroquímico de protones y energizar la toma de nutrientes. También juega un papel importante en la respuesta a estreses abióticos como la sequía, salinidad y frío. Ello nos hace pensar que esta enzima debe tener una regulación muy fina de su actividad que todavía no está caracterizada. Nuestro laboratorio ha descrito que ABA, la hormona inhibidora del crecimiento inhibe esta H+-ATPasa en raíces de Arabidopsis por un mecanismo que implica los receptores PYR/PYL, las proteínas fosfatasas inhibidas por ABA (ABI1, ABI2, HAB1 y PP2C-A) y las proteína kinasas SnRK2.2, 2.3 y 2.6 activadas por esta hormona. La sobreexpresión de la proteína fosfatasa HAB1 (35SCaMV::HAB1) impide esta inhibición de la H+-ATPasa (Planes et al., J. 2014). La proteína kinasa SnRK2.7 comparte la misma secuencia que SnRK2.2 2.3 y 2.6 en el bucle de activación (¿activation loop¿). Datos de expresión de las kinasas indican que a bajas temperaturas las kinasas SnRK2.6 y SnRK2.2 bajan su expresión. Por el contrario, SnRK2.7 incrementa sus niveles de mRNA volviéndose así la SnRK2 más importante en la regulación del crecimiento celular en condiciones de frío. De acuerdo con estos resultados, el fenotipo del mutante simple de pérdida de función de la kinasa SnRK2.7 (snrk2.7-1) pudo observarse a 6¿C pues en frío tiene un crecimiento mayor tanto en parte la aérea como en la raíz en comparación con la línea control. Por otra parte, varias líneas independientes de ganancia de función de SnRK2.7 (pUBI10::SnRK2.7) desarrolladas en este proyecto muestran un crecimiento general reducido en frío con respecto a las plantas control y las células de estas líneas son más pequeñas que en el control. Para averiguar el mecanismo de regulación del crecimiento por SnRK2.7 medimos la actividad de la H+-ATPasa de raíz y vimos que las líneas de sobreexpresión (pUBI10::SnRK2.7) tienen menos actividad de la enzima por falta de fosforilación en la penúltima treonina 947. Esto está de acuerdo con que las líneas de sobreexpresión, sin estrés, tienen los estomas más cerrados, indicando una menor actividad de la H+-ATPasa. Contrariamente a lo esperado, en experimentos de sequía notamos que las plantas más resistentes no son las de sobreexpresión de SnRK2.7, con estomas más cerrados, sino más bien las del mutante simple snrk2.7-1 y las de este mutante cruzado con plantas que sobreexpresan la proteína fosfatasa HAB1 (35SCaMV::HAB1). Esto sugiere que la resistencia a sequía se favorece con mayor actividad de la H+-ATPasa, no con menor actividad. La actividad de SnRK2.7 puede ser importante en frío para bajar la actividad de la H+-ATPasa e inhibir el crecimiento de la planta hasta que la temperatura sea más favorable para completar el ciclo reproductivo de la planta. Quisimos probar también en plantas de tomate la expresión de las SnRK2 ortólogas a las de Arabidopsis tanto en raíz como en fruto a diferentes temperaturas. Y vimos que las SnRK2 de tomate conservan el mismo tipo de regulación que en Arabidopsis, siendo el ortólogo en tomate de SnRK2.7 el gen más expresado en frío. Estos resultados nos sugirieron la creación de vectores para conseguir en un futuro líneas de tomate con pérdida de función de slSnRK2.7 (mediante la edición con CRISPR/CAS9) que puedan crecer y fructificar a temperaturas más bajas.

[EN] Plasmatic membrane H+-ATPase is the key to control the growth by plants, generating an electrochemical gradient of protons and energizing the nutrient uptake. It has an important role in abiotic stress as drought, salinity and cold. We think that this enzyme could have a fine-tuned regulation which it¿s not yet characterized. In our laboratory has been described that ABA, the growth inhibitory hormone, inhibits the H+-ATPase in Arabidopsis root using a mechanism that imply a PRY/PYL receptors, inhibited phosphatase proteins by ABA (ABI1, ABI2, HAB1 and PP2C-A) and protein kinases SnRK2.2, 2.3 and 2.6 that are activated by this hormone. The overexpression of HAB1 protein phosphatase (35SCaMV::HAB1) prevents the inhibition of H+-ATPase (Planes et al., J. 2014). Protein kinase SnRK2.7 shares the same sequence in the activation loop with SnRK2.2, 2.3 and 2.6. Expression data indicates at low temperature a drop expression of SnRK2.6 and SnRK2.2 kinases. Otherwise, SnRK2.7 enhances its levels of mRNA tuning in the most important SnRK2 cellular growth regulation in cold conditions. According to these results, the function loss of simple mutant phenotype of kinase SnRK2.7 (snrk2.7-1), we observe at 6¿C an enhanced aerial and root growth than control. On the other hand, various independent overexpression lines of SnRK2.7 (pUBI10::SnRK2.7) develop in this project, show a general reduced growth in cold relative to control, and the cells are smaller than control. To find out the grow regulation mechanism in SnRK2.7, we measure the root H+-ATPase activity and we observed that the overexpression lines (pUBI10::SnRK2.7) have less enzymatic activity for the lack of phosphorylation in the threonine 947. Also, the overexpression lines, without stress, have more closed stomata, indicating a lower H+-ATPase activity. In contrast to expected, during drought experiments we observed that the most resistant plants are not the overexpression of SnRK2.7, with more closed stomata, but the simple mutant snrk2.7-1 and the crossing of this mutant with the overexpression of protein phosphatase HAB1 (35SCaMV::HAB1). This suggests that the drought resistance could be enhanced with higher activity of H+-ATPase, not less. SnRK2.7 could be important in cold to reduce H+-ATPase activity and inhibit the plant growth until a better temperature to complete the plant reproductive cycle. We also tried the expression of SnRK2 in tomato plants testing Arabidopsis orthologs candidates at different temperatures in root and fruit. And we observed that tomato SnRK2 conserve the same regulation as Arabidopsis, being the SnRK2.7 ortholog gen the most expressed in cold. These results suggested the creation of vectors to obtain in a future the loss of function slSnRK2.7 lines (using CRISPR/Cas9) than could growth and bear fruit in cold conditions.