ROLE OF IONS IN STEM CELLS SIGNALLING

Abstract

[ES] Los procesos de comunicación celular permiten a las células desarrollar una acción coordinada durante la embriogénesis y asimilar de forma coherente las señales recibidas a través del entorno. Algunas de las moléculas señalizadoras más usadas en la clínica y la investigación son las citoquinas. Sin embargo, existe una tendencia creciente en el uso de otro tipo de moléculas, como los iones metálicos. Algunos iones como el calcio y el zinc actúan como segundos mensajeros intracelulares. Otros como el litio son capaces de inactivar proteínas quinasa alterando rutas de señalización. En el desarrollo de esta tesis doctoral, se ha estudiado el efecto del zinc en células musculares de ratón, el papel del zinc en la auto-renovación de células madre embrionarias (CMEs), y el papel del litio en la diferenciación de CMEs. El estudio del efecto del zinc sobre los mioblastos demostró que el zinc es capaz de estimular la diferenciación de los mioblastos. El análisis del zinc intracelular, en los diferentes estadios de diferenciación de las células musculares, demostró que los miotubos eran capaces de albergar mayor cantidad de zinc en su interior. Los resultados mostraron que la adición de zinc extracelular estimula la fosforilación y activación de la proteína quinasa Akt. También se ha visto que el transportador de zinc, Zip7, es crítico en el proceso de diferenciación celular mediado por el zinc, además, su activación incrementa la fosforilación de Akt. La inhibición de Zip7 mediante ARN interferente redujo la fosforilación de Akt y consecuentemente origino unos niveles menores de diferenciación de los mioblastos expuestos a zinc extracelular. Nuestros resultados demuestran que altas concentraciones de zinc extracelular producen un incremento en la diferenciación de los mioblastos debido a la activación de Akt mediada por Zip7. Para el segundo estudio, se analizó el efecto del zinc sobre las CMEs. Como control de mantenimiento de la pluripotencia se usó medio suplementado con factor inhibidor de leucemia (LIF). Se ha observado que la adición externa de concentraciones de zinc superiores a 100 µM produce un incremento inmediato de la concentración de zinc intracelular activando Akt. Los resultados demuestran que las células tratadas con altas concentraciones de zinc mantienen su capacidad de auto-renovación. Para demostrar que el efecto del zinc en CMEs está asociado a la activación de Akt mediada por Zip7, se inhibió la fosforilación de Akt y se silenció Zip7. Ambos abordajes dieron como resultado un incremento en la diferenciación de las células tratadas con zinc. Por otro lado, CMEs cultivadas durante 30 días en presencia de zinc fueron capaces de retener su pluripotencia, mientras que el control sin zinc presentaba rasgos claros de diferenciación celular. Por último, la combinación de LIF con zinc produjo un incremento importante del efecto del LIF en cuanto al mantenimiento de la capacidad de auto-renovación celular. Por último, se ha estudiado el efecto del litio en la diferenciación de las CMEs. El litio es un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3ß (GSK3ß). En términos de CMEs, GSK3ß activa los mecanismos de diferenciación. Los resultados obtenidos indican que altas concentraciones de litio (10 mM) son capaces de fosforilar e inhibir la proteína GSK3ß. Sin embargo, en lugar de mantener la pluripotencia, las células madre se diferenciaron hacia el linaje del mesodermo tras 3 días de cultivo. Después de un total de 6 días, las células tratadas con 10 mM de litio presentaron características de endotelio hemogénico. La inhibición de GSK3ß dio como resultado la activación de la proteína ß-catenina, cuya actividad transcripcional es necesaria para la hematogénesis embrionaria. La capacidad de las células endoteliales con potencial hemogénico obtenidas de derivar en células madre hematopoyéticas fue confirmada tras su maduración durante 11 día

[CA] Els processos de comunicació cel·lular permeten a les cèl·lules desenvolupar una acció coordinada durant la embriogènesis y assimilar de forma coherent als senyals rebudes a través de l'entorn. Algunes de les molècules senyalitzadores més usades en la clínica i la investigació són les citocines. No obstant, hi ha una tendència creixent en l'ús d'un altre tipus de molècules, com els ions metàl·lics. Alguns ions com el calci i el zinc són capaços de dur a terme funcions de missatger secundari. Altres com el liti són capaços d'inactivar proteïnes quinasa alterant rutes de senyalització. Durant el desenvolupament d'aquest treball de tesi doctoral, s'ha estudiat l'efecte del zinc sobre mioblasts de ratolí, el paper del zinc en l'auto-renovació de les cèl·lules mare embrionàries (CMEs), i el paper del liti sobre la diferenciació de les CMEs. L'estudi de l'efecte del zinc sobre els mioblasts ha demostrat que el zinc és capaç d'incrementar la diferenciació dels mioblasts. L'anàlisi del zinc intracel·lular ha demostrat que els mioblasts diferenciats eren capaços d'albergar major quantitat de zinc intracel·lular. Els resultats han mostrat que suplementar les cèl·lules amb zinc extracel·lular produïx una major fosforilació i activació de la proteïna quinasa Akt. D'altra banda, s'ha observat que el transportador de zinc Zip7 es crític per a la diferenciació cel·lular mediada pel zinc. S'ha demostrat que l'activació d'aquest transportador mitjançant zinc extracel·lular és capaç d'incrementar la fosforilació d'Akt. La inhibició d'aquest transportador mitjançant ARN interferent ha donat com a resultat una menor fosforilació d'Akt i una menor diferenciació dels mioblasts exposats a zinc. Aquests resultats demostren que altes concentracions de zinc extracel·lular produeixen un incrementar la diferenciació dels mioblasts a causa de l'activació d'Akt per mitja de Zip7. Per al segon estudi, s'ha analitzat l'efecte del zinc sobre les CMEs. Com a control de manteniment de la pluripotència es va usar medi suplementat amb factor inhibidor de leucèmia (LIF). S'ha observat que les concentracions extracel·lulars de zinc a partir de 100 µM produïxen un increment immediat de la concentració intracel·lular, produint l'activació d'Akt per mitja de Zip7. Les CMEs tractades amb altes concentracions de zinc mantenen l'auto-renovació. Per demostrar que aquest efecte està associat a l'activació d'Akt mediada per Zip7, es va inhibir la fosforilació d'Akt i es va silenciar el transportador Zip7. Tots dos abordatges han donat com a resultat un increment en la diferenciació de les CMEs tractades amb zinc. D'altra banda, les CMEs van ser capaços de retenir la seva pluripotència després de ser cultivades durant 30 dies en presència de zinc, mentre que el control sense zinc presentava trets clars de diferenciació cel·lular. Finalment, la combinació de LIF amb zinc ha produit un increment sinèrgic de l'efecte del LIF. Finalment, també s'ha estudiat l'efecte del liti en la diferenciació de les CMEs. El liti és un inhibidor de la glicogen sintasa quinasa 3 beta (GSK3ß). En termes de CMEs, aquesta proteïna activa els mecanismes de diferenciació. Els resultats obtinguts indiquen que altes concentracions de liti (10 mM) tenen la capacitat de fosforilar i inhibir la proteïna GSK3ß. No obstant això, en lloc de mantenir la pluripotència, les CMEs es van diferenciar cap al llinatge del mesoderma després de 3 dies. Després d'un total de 6 dies, les cèl·lules tractades amb 10 mM de liti presentaven característiques d'endoteli hemogénic. La fosforilació de GSK3ß va donar com a resultat l'activació de la proteïna ß-catenina, l'activitat trasncripcional d'aquesta proteïna és necessària per a la hematogénesis embrionària. La capacitat de les cèl·lules endotelials amb potencial hemogénic obtingudes de derivar en cèl·lules mare hematopoètiques va ser confirmada després de la

[EN] The cell signalling process allows cells to develop a coordinated action during embryogenesis and assimilate coherently the signals received through the environment. Some of the most currently used signalling molecules in clinics and research are growth factors and cytokines. However, there is a growing trend in the use of other types of molecules, such as metal ions. Some ions such as calcium and zinc are able to carry out secondary messenger functions, transmitting signals in cascade. Others ions, such as lithium, are capable to inactivate protein kinases altering signalling pathways. During the development of this doctoral thesis, we investigated the effect of zinc on mouse muscle cells (myoblasts), the role of zinc in embryonic stem cells (ESCs) self-renewal, and the role of lithium in the differentiation of ESCs. In the first chapter, we showed that zinc is able to increase the differentiation of myoblasts. The analysis of intracellular zinc indicated that the differentiated myoblasts were capable to harbour higher concentration of intracellular zinc than undifferentiated ones. Addition of high concentration of extracellular zinc increased protein kinase Akt phosphorylation and activation. Akt activity is critical for myoblasts differentiation and has been well studied by other authors. Our results indicated that zinc transporter Zip7 was critical for zinc-mediated cell differentiation. It was prior demonstrated that the activation of this transporter by extracellular zinc increased the phosphorylation of Akt. The inhibition of Zip7 by interfering RNA resulted in a lower phosphorylation of Akt and reduced differentiation of the myoblasts exposed to extracellular zinc. These results demonstrated that high concentration of extracellular zinc enhances the differentiation of myoblasts through activation of Akt mediated by Zip7. In the second chapter, we have analysed the effect of zinc on ESCs. Leukaemia inhibitory factor (LIF) was used as pluripotency sustaining factor. We observed that extracellular supplementation of 100 ¿M zinc produced an immediate increase of the intracellular concentration, which resulted in the activation of Akt mediated by Zip7 transporter. ESCs treated with high concentrations of zinc maintained self-renewal. The role of Akt on ESCs self-renewal has been well established in the literature. To demonstrate that this effect is associated with the activation of Akt mediated by Zip7, we inhibited Akt phosphorylation and silenced the expression of Zip7. Both approaches resulted in an increase in the differentiation levels of the ESCs treated with zinc. We further demonstrated that ESCs treated with zinc during 30 days were able to retain their pluripotency, while the control condition cultured 30 days without zinc presented evident traits of spontaneous cellular differentiation. Finally, the combination of LIF with zinc produced a synergistic-like increase in the effect of LIF on ESCs self-renewal. Finally, we addressed the effect of lithium on the differentiation of ESCs. Lithium is an inhibitor of glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3ß). In terms of ESCs, GSK3ß activates differentiation mechanisms. Our results indicated that high concentration of lithium (10 mM) was able to phosphorylate and strongly inhibit the activity of GSK3ß. However, instead of maintaining pluripotency, ESCs differentiated into the mesoderm lineage after 3 days of culture. After a total of 6 days, ESCs treated with 10 mM lithium showed haemogenic endothelium characteristics, expressing CD31, Sca-1 and CD31/Sca-1 positive cells. The phosphorylation of GSK3ß resulted in the activation of the ß-catenin protein, whose transcriptional activity is necessary for embryonic hematogenesis. The ability of endothelial cells with hemogenic potential obtained from lithium-treated ESCs to derive into hematopoietic stem cells was confirmed after maturation of these cells, resulting in rounded cell aggregates positive for Sox17.