El papel endógeno del nitrógeno en el retraso del cambio de color en los frutos cítricos

Abstract

[ES] La maduración externa de los frutos cítricos incluye el proceso de cambio de color o desverdizado del exocarpo. Este proceso consiste en la transformación de los cloroplastos en cromoplastos, produciéndose la degradación de clorofilas y la acumulación de carotenoides. Junto con otros factores reguladores de tipo exógeno (temperatura) y endógeno (hormonales y nutricionales), el nitrógeno forma parte de la señal que regula el cambio de color. La reducción de la concentración de nitrógeno en las células del exocarpo se correlaciona con el cambio de color, mientras que su aplicación exógena retrasa este proceso. La represión de los genes de transportadores de nitrógeno en las células del exocarpo de mutantes de mandarina con retraso en el cambio de color sugiere que es necesaria la movilización de nitrógeno del flavedo para que se inicie el cambio de color. El presente trabajo estudia cómo la presencia continua de nitrógeno en las células del exocarpo interviene en el proceso de desverdizado y su relación con la asimilación de nitrato, el catabolismo proteico, el transporte de nitrógeno y las principales rutas metabólicas del cloroplasto derivadas del precursor común pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP). Para ello se analizó la evolución del color del flavedo de mandarino de variedades tardías (Citrus reticulata y C. sinensis x C.reticulata) al aplicarse de manera continuada nitrato a nivel de tejido in vitro, de fruto individual y de árbol completo. Las muestras de exocarpo de frutos de árboles tratados con nitrato se analizaron mediante RT-qPCR para estudiar los niveles de expresión génica de enzimas clave del metabolismo del nitrógeno, la síntesis de giberelinas y el cambio de color. El tratamiento produjo un retraso significativo en el cambio de color a todos los niveles, con un mayor efecto en el tratamiento a árbol completo. En ninguno de los casos se impidió el desverdizado ni se estimuló el reverdizado. La aplicación del nitrógeno bloqueó la expresión de la fitoeno sintasa (PSY), precursora de la síntesis de carotenoides, pero no modificó la síntesis de GGPP, giberelinas y clorofila, las otras rutas derivadas del precursor GGPP. Por otra parte, el aporte de nitrógeno resultó en un retraso significativo de la expresión de la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH), implicada en la deaminación del glutamato durante la hidrólisis proteica, y en un aumento de la expresión de la enzima nitrito reductasa (NiR). El gen del transportador de nitrógeno (NRT 1.2) presentó un aumento de su expresión previo al inicio del cambio de color independientemente de la aplicación de nitrato. La alteración de los procesos de acumulación de carotenoides y de degradación de proteínas durante la transformación de cloroplastos a cromoplastos explican en parte el retraso del cambio de color por aplicación de nitrato. La activación de los transportadores que median la reducción de nitrógeno en las células del exocarpo necesaria para el cambio de color parece un proceso constitutivo, independiente al nitrógeno exógeno.

[EN] External fruit ripening in citrus fruits includes the process of color break or degreening of the exocarp. The degreening process entails the transformation of chloroplasts into chromoplasts, causing the degradation of chlorophylls and the accumulation of carotenoids. Along with other exogenous (temperature) and endogenous (hormonal and nutritional) regulatory factors, nitrogen takes part in the signal regulating color change. The decrease of nitrogen concentration in exocarpic cells correlates with the degreening process, whereas nitrogen exogenous application delays this process. As nitrogen membrane transporters are repressed in the exocarp of mandarin mutants with color change delay, mobilization of nitrogen from the flavedo is suggested to be necessary for the color change to begin. This work aims to study the relation between permanent nitrogen presence in flavedo cells and the degreening process and its interaction with nitrate assimilation, protein catabolism, nitrogen transport and the main metabolic pathways of the chloroplast derived from the common precursor geranilgeranil pyrophosphate (GGPP). For this purpose, the evolution of flavedo colour was analysed in late ripening mandarin varieties (Citrus reticulata y C. sinensis x C.reticulata) under nitrate treatment applied to in vitro tissue, single fruit and complete tree. The effect of the treatment in genetic expression of key enzymes in nitrogen metabolism, gibberellin synthesis and color change was evaluated by RT-qPCR. The treatment produced a significant delay in the color change, with a greater effect on the complete tree treatment. In none of the cases was degreening prevented or regreening stimulated. The application of nitrogen blocked the expression of phytoene synthase (PSY), a precursor of the synthesis of carotenoids, but did not modify the synthesis of GGPP, gibberellins or chlorophyll, the other routes derived from the GGPP precursor. The nitrogen supply resulted in a significant delay in the expression of the enzyme glutamate dehydrogenase (GDH), involved in the deamination of glutamate during protein hydrolysis, and an increase in the relative expression of nitrite reductase (NiR). The nitrogen transporter gene (NRT 1.2) showed an increase in its expression prior to the onset of color change regardless of the application of nitrate. Disruption in carotenoid accumulation and protein degradation during chloroplast to chromoplast transformation partially explains the delay in flavedo colour change as a result of nitrate supply. The upregulation of nitrogen transporters involved in the mobilization of exocarp nitrogen content required for degreening seems to be a constitutive process, independent to exogenous nitrogen.

[CA] La maduració externa dels fruits cítrics inclou el procés de canvi de color o desverdat de l’exocarp. Aquest procés consisteix en la transformació dels cloroplasts en cromoplasts, produint-se la degradació de clorofil·les i l'acumulació de carotenoides. Juntament amb altres factors reguladors de tipus exogen (temperatura) i endogen (hormonals i nutricionals), el nitrogen forma part del senyal que regula el canvi de color. La reducció de la concentració de nitrogen en les cèl·lules de l’exocarp es correlaciona amb el canvi de color, mentre que la seua aplicació exògena retarda aquest procés. La repressió dels gens de transportadors de nitrogen en les cèl·lules de l’exocarp de mutants de mandarina amb retard en el canvi de color suggereix que és necessària la mobilització de nitrogen del flavedo perquè es s’inicie el canvi de color. El present treball estudia com la presència contínua de nitrogen en les cèl·lules de l’exocarp intervé en el procés de desverdat i la seua relació amb l'assimilació de nitrat, el catabolisme proteic, el transport de nitrogen i les principals rutes metabòliques del cloroplast derivades del precursor comú pirofosfat de geranilgeranil (GGPP). Per a això es va analitzar l'evolució del color del flavedo de mandariner de varietats tardanes (Citrus reticulata i C. sinensis x C.reticulata) en aplicar-se de manera continuada nitrat a nivell de teixit in vitro, de fruit individual i d'arbre complet. Les mostres de exocarp de fruits d'arbres tractats amb nitrat es van analitzar mitjançant RT-qPCR per a estudiar els nivells d'expressió gènica d'enzims clau del metabolisme del nitrogen, la síntesi de giberel·lines i el canvi de color. El tractament va produir un retard significatiu en el canvi de color a tots els nivells, amb un major efecte en el tractament a arbre complet. En cap dels casos es va impedir el desverdat ni es va estimular el reverdejat. L'aplicació del nitrogen va bloquejar l'expressió de la fitoena sintetasa (PSY), precursora de la síntesi de carotenoides, però no va modificar la síntesi de GGPP, giberel·lines i clorofil·la, les altres rutes derivades del precursor GGPP. D'altra banda, l'aportació de nitrogen va resultar en un retard significatiu de l'expressió de l'enzim glutamat deshidrogenasa (GDH), implicada en la deaminació del glutamat durant la hidròlisi proteica, i en un augment de l'expressió de l'enzim nitrit reductasa (NiR). El gen del transportador de nitrogen (NRT 1.2) va presentar un augment de la seua expressió previ a l'inici del canvi de color independentment de l'aplicació de nitrat. L'alteració dels processos d'acumulació de carotenoides i de degradació de proteïnes durant la transformació de cloroplasts a cromoplasts expliquen en part el retard del canvi de color per aplicació de nitrat. L'activació dels transportadors que medien la reducció de nitrogen en les cèl·lules de l’exocarp necessària per al canvi de color sembla un procés constitutiu, independent al nitrogen exogen.