Human milk microbiota and its relationship with milk components in health and during lactational mastitis

Abstract

[ES] Antecedentes: La leche humana es el alimento natural ideal para el desarrollo y la protección del recién nacido y el niño en crecimiento. Estudios recientes han demostrado la presencia de bacterias en la leche humana en condiciones de salud, y se cree que podrían conferir propiedades beneficiosas para el bebé. Sin embargo, poco se sabe sobre la relación entre las bacterias y los macronutrientes de la leche y las células humanas, y no existe un protocolo óptimo para estimar el número de bacterias en las muestras. Además, hasta la fecha no se ha explorado la posible presencia de hongos en la leche humana, a pesar de que previamente éstos se han encontrado en la leche de otros animales y en el intestino neonatal. Por otro lado, la etiología de la mastitis sub-aguda no está bien descrita, y esfuerzos para describir la composición de la microbiota de la leche durante este proceso por medio de tecnologías de secuenciación próxima, y su potencial implicación en la enfermedad son escasos. Esta tesis está dirigida a mejorar nuestra comprensión de la microbiota de la leche humana, su composición y diversidad, e interacciones con otros componentes de la leche en condiciones de salud y durante la mastitis sub-aguda. También exploramos el efecto potencial de factores ambientales, como el tipo de parto y el origen geográfico, y el periodo de la lactancia en la composición de la microbiota de la leche. Métodos: Se utilizaron tecnologías de secuenciación de próxima generación dirigidas al gen bacteriano 16S rRNA y a los genes fúngicos 28S rRNA y la región ITS1, en combinación con análisis microbiológicos clásicos, para evaluar la composición bacteriana y fúngica en la leche de madres sanas, y de madres con mastitis sub-aguda. Las cargas bacterianas y fúngicas en la leche humana se obtuvieron mediante la metodología qPCR calibrada con citometría de flujo. Resultados: La composición bacteriana en la leche humana tiene una alta variabilidad interindividual, y también a lo largo del tiempo, y está compuesta predominantemente por bacterias de la familia Staphylococacceae. Se encontró un "núcleo" de bacterias y hongos en la leche humana de donantes españolas. Se observaron algunas correlaciones entre bacterias con los macronutrientes de la leche y células somáticas humanas, lo que indica una relación activa entre microbiota y ambiente. La carga bacteriana resultó ser más alta que lo estimado previamente, a una media de 106 células/ml, presentes en estado libre y asociadas a células humanas. No se observaron correlaciones entre carga bacteriana, número de células somáticas, y la riqueza y diversidad bacteriana, lo que podría indicar que un aumento en la densidad bacteriana en condiciones de salud no activa una respuesta inmune en la glándula mamaria, ni altera la comunidad microbiana. Además, nuestros resultados revelaron la existencia de hongos en la leche humana que se confirmó mediante métodos de cultivo y microscopía. El 89% de las muestras españolas analizadas tenían niveles detectables de ADN fúngico, con una carga aproximada de 105 células/ml. Malassezia, Candida y Saccharomyces eran prevalentes en las muestras, y se observaron diferentes interacciones fúngicas con los componentes de la leche. La presencia de hongos en la leche se confirmó posteriormente en muestras de orígenes geográficos distantes, y se observó que factores maternos y tipo de parto pueden afectar a las comunidades microbianas de la leche. Tras describir la microbiota de la leche en condiciones de salud, realizamos un estudio observacional prospectivo de casos/controles, donde se estudió el ADN y el ARN de la microbiota de la leche de madres sanas y madres con mastitis sub-aguda, antes y después del tratamiento. La carga bacteriana aumentó durante la enfermedad, la diversidad disminuyó y las alteraciones en la composición bacteriana probablemente reflejen un proceso disbiótico en la glándula mamari

[CA] Antecedents: La llet humana és l'aliment natural ideal per al desenvolupament i la protecció del nadó i el nen en creixement. Estudis recents han demostrat la presència de bacteris a la llet humana en condicions normals de salut, i es creu que podrien conferir propietats beneficioses per al nadó. No obstant això, poc se sap sobre la relació entre els bacteris i els macronutrients de la llet i les cèl·lules humanes, i no hi ha un protocol òptim per estimar el nombre de bacteris en les aquestes mostres. A més, fins a la data no s'ha explorat la possible presència de fongs en la llet humana, tot i que prèviament s'havien trobat en la llet d'animals i en l'intestí neonatal. D'altra banda, l'etiologia de la mastitis sub-aguda no està ben descrita, i esforços per descriure la composició de la microbiota de la llet durant aquest procés per mitjà de tecnologies de seqüenciació propera, i la seua potencial implicació en la malaltia són escassos. Aquesta tesi està dirigida a millorar la nostra comprensió de la microbiota de la llet humana, la seva composició i diversitat, i les interaccions amb altres components de la llet, en condicions de salut i durant la mastitis sub-aguda. També explorem l'efecte potencial de factors ambientals, com el tipus de part i l'origen geogràfic, i el període de la lactància en la composició de la microbiota de la llet humana. Mètodes: Es van utilitzar tecnologies de seqüenciació de pròxima generació dirigides al gen bacterià 16S rRNA i als gens fúngics 28S rRNA i la regió ITS1, en combinació amb anàlisis microbiològiques clàssics, per avaluar la composició bacteriana i fúngica en la llet de mares sanes i de mares amb mastitis sub-aguda. Les quantitats bacterianes i fúngiques en la llet humana es van obtenir mitjançant la metodologia qPCR calibrada amb citometria de flux. Resultats: La composició bacteriana en la llet humana té una alta variabilitat interindividual, i també al llarg del temps, i està composta predominantment per bacteris de la família Staphylococacceae. Es va trobar un "nucli" de bacteris i fongs a la llet humana de donants espanyoles. Es van observar algunes correlacions entre bacteris amb els macronutrients de la llet i cèl·lules somàtiques humanes, el que indica una relació activa entre la microbiota de la llet i el medi. La densitat bacteriana va resultar ser més alta que l'estimat prèviament, a una mitjana de 106 cèl·lules/ml, presents en estat lliure i associades a cèl·lules humanes. No es van observar correlacions entre càrrega bacteriana, el nombre de cèl·lules somàtiques, i la riquesa i diversitat bacteriana, la qual cosa podria indicar que un augment en la densitat bacteriana en condicions de salut no activa una resposta immune en la glàndula mamària, ni alteren la comunitat microbiana. A més, els nostres resultats de seqüenciació van revelar l'existència de certa diversitat de fongs a la llet humana que es va confirmar mitjançant mètodes de cultiu i microscòpia. El 89% de les mostres espanyoles analitzades tenien nivells detectables d'ADN fúngic, amb una càrrega mitjana de 105 cèl·lules/ml. Malassezia, Candida i Saccharomyces eren prevalents en les mostres, i es van observar interaccions fúngiques amb els components de la llet de diferents maneres. La presència de fongs a la llet es va confirmar posteriorment en mostres d'orígens geogràfics distants, i es va observar que els factors materns i de part poden afectar les comunitats microbianes de la llet. Després de descriure la microbiota de la llet en condicions de salut, vam realitzar un estudi observacional prospectiu de casos/controls, on es va estudiar l'ADN i l'ARN de la microbiota de la llet humana de mares sanes i mares amb mastitis sub-aguda, abans i després del tractament. La càrrega bacteriana va augmentar durant la malaltia, la diversitat va disminuir i les alteracions en la composició bacteriana probablement reflecteixin un procés d

[EN] Background: Human milk is nature's ideal food for the nurture and protection of the new-born and growing infant. Recent evidence reported the presence of bacteria in human milk under normal, healthy conditions, which are thought to confer beneficial properties to the infant. However, little is known about the relationship between bacteria and milk macronutrients and human cells, and there is no optimal protocol to estimate bacterial numbers in the samples. Also, the potential presence of fungi in human milk has not been explored to date, despite the fact that fungi has been previously detected in dairy animal's milk and in the neonatal gut. In addition, the aetiology of sub-acute mastitis is not well understood, and information about the composition of the milk microbiota during this process by means of next-generation sequencing and its potential implications in the disease is scarce. This thesis is aimed to improve our understanding of human milk microbiota, its composition and diversity as well as the interactions with other milk components, in health and during sub-acute mastitis. We also explore the potential effect of environmental factors, such as mode of delivery and geographic location, and the lactation stage on milk's microbiota composition. Methods: Next-generation sequencing technologies targeting the bacterial 16S rRNA gene, and the fungal 28S rRNA gene and ITS1 genetic region, in combination with classic microbiological analyses, were used in order to assess the bacterial and fungal composition in milk of healthy mothers, and in mothers suffering sub-acute mastitis. Bacterial and fungal loads in human milk were obtained by qPCR methodology calibrated with flow cytometry. Results: Bacterial composition in human milk has a high inter-individual variability, and also over time, and is predominantly comprised of bacteria from the Staphylococacceae family. A bacterial and fungal "core" were found in the human milk of Spanish donors. Some correlations were observed between bacteria with milk macronutrients and somatic cells, indicating an active relationship between milk microbiota and the environment. Bacterial density appeared to be higher than previously estimated, at a mean of 106 cells/ml, and bacteria were found both in a free-living state and associated to human cells. No correlations were observed between bacterial load with number of somatic cells nor bacterial richness and diversity, indicating that higher bacterial densities under healthy conditions do not trigger an immune response in the mammary gland, nor alter the microbial community. In addition, our results revealed the existence of certain diversity of fungi in human milk that was further confirmed by culture-dependent methods and microscopy. 89% of the Spanish samples analysed had detectable levels of fungal DNA, at a median load of approximately 105 cells/ml. Malassezia, Candida and Saccharomyces prevailed in the samples, and fungi interacted with milk components in different ways. The presence of fungi in milk was further confirmed in samples from distant geographic origins, and it was observed that maternal and delivery factors can impact milk microbial communities. After describing milk microbiota in healthy conditions, we performed an observational, prospective case-control study, where DNA and RNA from human milk microbiota from healthy and sub-acute mastitis-suffering mothers were studied before and after the treatment. Bacterial loads increased during the disease, diversity decreased and alterations in bacterial composition likely reflected a dysbiotic process in the mammary gland. This supports that sub-acute mastitis is a microbial-driven disease.