Improvement of techniques for sperm evaluation and cryobanking in European eel

Abstract

[ES] En las últimas décadas, la anguila europea Anguilla anguila ha sufrido una disminución drástica de su población lo que ha llevado su inclusión como especie en peligro crítico en la lista roja UICN. Esta situación, junto con la gran importancia comercial de esta especie, evidencia la necesidad de tomar acciones como el desarrollo de la reproducción en cautividad y el control de la pesca. Una de las herramientas más interesantes para su uso en la biología de la conservación es la criopreservación de espermatozoides, que presenta varias ventajas para esta especie, incluyendo la sincronización de gametos, la selección de líneas genéticas o su uso para la creación de un criobanco. Sin embargo, el desarrollo de protocolos de criopreservación necesariamente requieren esperma de buena calidad. Además, se necesita un método preciso para evaluar la calidad del esperma tanto antes como después de la criopreservación. Sobre esta última cuestión, la motilidad de los espermatozoides de los peces se considera uno de los mejores biomarcadores para la evaluación de la calidad de los espermatozoides en los peces, y se puede estudiar de forma subjetiva u objetiva utilizando sistemas "computer assisted sperm analysis" (CASA-Mot). Primero, se realizó un experimento para evaluar la precisión y la exactitud de ambos métodos para estudiar la motilidad del esperma: el método subjetivo y la técnica objetiva que utiliza el sistema CASA-Mot. Además, se probó si el grado de experiencia de los técnicos en el caso del método subjetivo tiene un efecto en la precisión de la estimación de la motilidad y, por lo tanto, hay una influencia del personal del laboratorio en la evaluación de la motilidad del esperma. Aquí concluimos que tanto el método como la experiencia técnica eran factores clave para evaluar con precisión la motilidad del esperma en la anguila europea, por lo que se requiere el uso de CASA-Mot junto con material calificado para obtener resultados fehacientes. En segundo lugar, se evaluaron métodos alternativos para la maduración de los machos de anguila europeos probando dos tratamientos hormonales diferentes: OVI, una gonadotropina recombinante; y VET, una gonadotropina purificada a partir de orina femenina. Después de elegir el mejor tratamiento hormonal de los dos, se evaluó el efecto de tres dosis diferentes con el objetivo de obtener el mayor rendimiento al menor coste. Los resultados de este experimento apuntaron a OVI como el mejor tratamiento hormonal en una dosis semanal de 1.5 UI/g de pez, que proporciona la mayor rentabilidad, obteniendo esperma de alta calidad a menor precio. En un tercer experimento, y utilizando los conocimientos adquiridos en los dos primeros experimentos, se realizaron una serie de experimentos para estandarizar los protocolos de criopreservación de esperma de anguila europea disponibles en ese momento (utilizando DMSO o metanol como crioprotector). Los resultados apuntaron al protocolo que utiliza el metanol como el mejor de ellos dos en términos de motilidad, velocidad y viabilidad de los espermatozoides y la preservación de la integridad del ADN. Siguiendo este último método estandarizado, se realizó un cuarto experimento con el objetivo de mejorar el protocolo en términos de volumen (volúmenes de esperma más grandes) y de calidad espermática. Además, se desarrolló un protocolo simple de almacenamiento a corto plazo para complementar las opciones de preservar el esperma durante diferentes períodos de tiempo. De todas las condiciones de almacenamiento probadas, las diluciones 1/50 a 4 ºC mostraron los mejores resultados, manteniendo la motilidad en comparación con el control durante 3 días, y manteniendo cierta motilidad espermática (12%) después de 7 días. A partir del experimento de criopreservación, fue posible aumentar los volúmenes a 2 y 5 mL sin perder la calidad del esperma en comparación con volúmenes más pequeños, y mejorando las mot

[CA] En les últimes dècades, l'anguila europea Anguilla anguila ha sofert una disminució dràstica de la seva població el que ha portat la seva inclusió com a espècie en perill crític en la llista vermella UICN. Aquesta situació, juntament amb la gran importància comercial d'aquesta espècie, evidencia la necessitat de prendre accions com el desenvolupament de la reproducció en captivitat i el control de la pesca. Una de les eines més interessants per al seu ús en la biologia de la conservació és la criopreservació d'espermatozoides, que presenta diversos avantatges per a aquesta espècie, incloent la sincronització de gàmetes, la selecció de línies genètiques o el seu ús per a la creació d'un criobanc. No obstant això, el desenvolupament de protocols de criopreservació necessàriament requereixen esperma de bona qualitat. A més, es necessita un mètode precís per avaluar la qualitat de l'esperma tant abans com després de la criopreservació. Sobre aquesta última qüestió, la motilitat dels espermatozoides dels peixos es considera un dels millors biomarcadors per a l'avaluació de la qualitat dels espermatozoides en els peixos, i es pot estudiar de forma subjectiva o objectiva utilitzant sistemes "computer assisted sperm analysis" (CASA-Mot). Primer, es va realitzar un experiment per avaluar la precisió i l'exactitud de tots dos mètodes per estudiar la motilitat de l'esperma: el mètode subjectiu i la tècnica objectiva que utilitza el sistema CASA-Mot. A més, es va provar si el grau d'experiència dels tècnics en el cas del mètode subjectiu té un efecte en la precisió de l'estimació de la motilitat i, per tant, hi ha una influència del personal del laboratori en l'avaluació de la motilitat del esperma. Vam concloure que tant el mètode com l'experiència tècnica eren factors clau per avaluar amb precisió la motilitat de l'esperma en l'anguila europea, de manera que es requereix l'ús de CASA-Mot juntament amb material qualificat per obtenir resultats fefaents. En segon lloc, es van avaluar mètodes alternatius per a la maduració dels mascles d'anguila europeus provant dos tractaments hormonals diferents: OVI, un gonadotropina recombinant; i VET, un gonadotropina purificada a partir d'orina femenina. Després de triar el millor tractament hormonal dels dos, es va avaluar l'efecte de tres dosis diferents amb l'objectiu d'obtenir el major rendiment al menor cost. Els resultats d'aquest experiment van apuntar a OVI com el millor tractament hormonal en una dosi setmanal de 1.5 UI/g de peix, que proporciona la major rendibilitat, obtenint esperma d'alta qualitat a un preu millor. En un tercer experiment, i utilitzant els coneixements adquirits en els dos primers experiments, es van realitzar una sèrie d'experiments per estandarditzar els protocols de criopreservació d'esperma d'anguila europea disponibles en aquest moment (utilitzant DMSO o metanol com crioprotector). Els resultats van apuntar al protocol que utilitza el metanol com el millor d'ells dos en termes de motilitat, velocitat i viabilitat dels espermatozoides i la preservació de la integritat de l'ADN. Seguint aquest últim mètode estandarditzat, es va realitzar un quart experiment amb l'objectiu de millorar el protocol en termes de volum (volums d'esperma més grans) i de qualitat espermàtica. A més, es va desenvolupar un protocol simple d'emmagatzematge a curt termini per complementar les opcions de preservar l'esperma durant diferents períodes de temps. De totes les condicions d'emmagatzematge provades, les dilucions 1/50 a 4ºC van mostrar els millors resultats, mantenint la motilitat en comparació amb el control durant 3 dies, i mantenint certa motilitat espermàtica (12%) després de 7 dies. A partir de l'experiment de criopreservació, va ser possible augmentar els volums a 2 i 5 ml sense perdre la qualitat de l'esperma en comparació amb volums més petits.

[EN] In the last decades, the European eel Anguilla anguilla has suffered a drastic decrease in the recruitment in most areas of their distribution range, leading the species to be included as critically endangered in the IUCN list. This situation, together with the high commercial importance of the species, evidence the need of taking actions such as development of reproduction in captivity and control of fisheries based on the complexity of their life cycle. One of the most interesting tools for its use in conservation biology is the sperm cryopreservation, which presents several advantages for this species such as the synchronization of gametes, selection of genetic lines or cryobanking. However, the development of cryopreservation protocols necessarily requires good quality sperm, and it is also needed an accurate method to assess sperm quality both pre- and post-cryopreservation. On this last matter, fish sperm motility is considered one of the best quality biomarkers for sperm quality assessment in fish, and it can be evaluated subjectively or objectively using computer assisted sperm analysis (CASA-Mot) systems. First, an experiment was conducted to evaluate the precision and accuracy of both methods for assessing sperm motility: the subjective method and the objective technique using CASA-Mot system. Moreover, it was tested whether the degree of expertise of the technicians in the case of the subjective method, has an effect on the accuracy of the motility estimation, and therefore there is an influence of the laboratory staff on the sperm motility assessment. Here we concluded that both the method and the technician expertise were key factors in order to accurately assess sperm motility in European eel, so the use of CASA-Mot together with qualified stuff is required to obtain reliable results. Secondly, and alternative methods for European eel males maturation was evaluated by testing two different hormonal treatments: OVI, a recombinant ¿-choriogonadotropin; and VET, a human chorionic gonadotropin purified from female urine. After choosing the best hormonal treatment, the effect of three different doses was evaluated aiming for best performance and lowest cost on the treatment. The results of this experiment pointed at OVI as the best hormonal treatment in terms on sperm quantity and quality in most of the weeks of treatment, and at a weekly dose of 1.5 IU/g fish, which also provide the greatest profitability, obtaining high quality sperm at a lower price. In a third experiment, and using the knowledge acquired in the two first experiments (using the OVI hormonal treatment and CASA-Mot to assess sperm quality), a series of experiments were conducted to standardize the European eel sperm cryopreservation protocols available at the moment (using DMSO or methanol as cryoprotectant). The results indicated that the protocol using methanol was the best of them two in terms of sperm motility and velocity, sperm viability and preservation of DNA integrity. Following this last standardized method, a fourth experiment was conducted aiming for improvement of the protocol in terms of volume (larger volumes) and sperm quality outcome. Moreover, a simple protocol for short-term storage was developed to complement the options to preserve sperm for different time periods. Of all the tested storing conditions, 1/50 dilutions at 4 ºC showed the best results, maintaining the motility compared to control for 3 days, and some sperm motility (12%) was still observed after 7 days. From the cryopreservation experiment, it was possible to scale up the cryopreserved volumes to 2 and 5 mL without losing sperm quality compared to lower volumes. Moreover, the protocol was further improved by supplementing the protocol with egg yolk as an additive, obtaining the highest cryopreserved sperm motilities (over 50%) ever reported in European eel.