Sistema de biosensado fotónico para la detección de trombina, alérgenos y patógenos. funcionalización química de chips fotónicos basados en estructuras de anillos resonantes

Abstract

[ES] En este trabajo se ha realizado la detección de analitos implicados en el sector sanitario (trombina) e industria alimentaria (alérgenos y patógenos), mediante el uso de un sistema de biosensado fotónico. Este sistema desarrollado por el equipo de LUMENSIA Sensors, emplea la tecnología de chips fotónicos de nitruro de silicio (Si3N4), basados en estructuras de anillos resonantes (RR). Las estrategias de funcionalización química e inmovilización de biomoléculas como aptámeros (fragmentos de ADN de cadena sencilla) y anticuerpos, se han realizado sobre superficies planas de Si3N4 para la detección de analitos, como paso previo a las medidas fotónicas. Por tanto, estas estrategias se han implementado en la preparación del chip fotónico para las medidas en un entorno de laboratorio (set-up). En cuanto a la estrategia aplicada, ésta consiste en la activación química de la superficie del sensor. Después sobre los RR del chip, cuyo tamaño es del orden de las micras, se inmoviliza la sonda de captura (anticuerpo o aptámero), siendo ésta la encargada de reconocer específicamente al analito de interés (trombina, alérgeno o patógeno). En los resultados obtenidos de trombina, se ha elaborado un estudio para la detección de trombina en el seno de diferentes matrices biológicas sobre superficies planas de Si3N4, además del control sobre la activación de una muestra de sangre mediante el uso de factor tisular (TF) y cloruro de calcio (CaCl2). Estos resultados han servido como un estudio preliminar a la optimización del aptámero empleado como sonda de captura, específico de la trombina para su detección sobre chips fotónicos. En lo referente a la detección de alérgenos, se han empleado dos estrategias claramente diferenciadas. Por un lado, la utilización de aptámeros como sondas de captura en la detección del Ovomucoide (OVO) y la Gliadina (GLN) sobre superficies planas Si3N4. Por otro lado, la implementación de anticuerpos monoclonales como moléculas biológicas de captura sobre chips fotónicos, se ha llevado a cabo en la detección de los alérgenos Gliadina (GLN) y caseína (CAS), cuyos resultados han dado lugar a una recta de calibrado. Asimismo, se ha realizado un ensayo para la detección de GLN en muestra real, procedente de un extracto cárnico con gluten de trigo. En cuanto a la detección de patógenos, se han utilizado dos tipos de estrategias, al igual que para los alérgenos. En primer lugar, el uso de aptámeros como sondas de captura han dado como resultado la detección de dos cepas de carácter no patogénico de la bacteria E.coli (Origami y XL1BLUE) sobre superficies planas de Si3N4. En segundo lugar, la utilización de un anticuerpo policlonal como sonda de captura, se ha inmovilizado sobre la superficie del chip fotónico para la detección del Circovirus Porcino tipo 2 (PCV2) en un estudio realizado sobre la dosis dependencia del virus a diferentes factores de dilución. Finalmente, el desarrollo de una plataforma de sensado para la detección de los analitos (trombina, alérgenos y patógenos) y donde se vayan a implementar los diferentes biosensores está en proceso.

[CA] En aquest treball s'ha realitzat la detecció d'anàlits implicats en el sector sanitari (trombina) i indústria alimentària (al·lergògens i patògens), mitjançant l'ús d'un sistema de biosensat fotònic. Aquest sistema desenvolupat per l'equip de LUMENSIA Sensors, empra la tecnologia de xips fotònics de nitrur de silici (Si3N4), basats en estructures d'anells ressonants (RR). Les estratègies de funcionalització química i immobilització de biomolècules com aptàmers (fragments d'ADN de cadena senzilla) i anticossos, s'han realitzat sobre superfícies planes de Si3N4 per a la detecció d'anàlits, com a pas previ a les mesures fotòniques. Per tant, aquestes estratègies s'han implementat en la preparació del xip fotònic per a les mesures en un entorn de laboratori (set-up). Quant a l'estratègia aplicada, aquesta consisteix en l'activació química de la superfície del sensor. Després sobre els RR del xip, la grandària del qual és de l'ordre de les micres, s'immobilitza la sonda de captura (anticòs o aptàmer), sent aquesta l'encarregada de reconèixer específicament a l'anàlit d'interés (trombina, al·lergogen o patogen). En els resultats obtinguts de trombina, s'ha elaborat un estudi per a la detecció de trombina en el si de diferents matrius biològiques sobre superfícies planes de Si3N4, a més del control sobre l'activació d'una mostra de sang mitjançant l'ús de factor tissular (TF) i clorur de calci (CaCl2). Aquests resultats han servit com un estudi preliminar a l'optimització del aptàmer empleat com sonda de captura, específic de la trombina per a la seua detecció sobre xips fotònics. Referent a la detecció d'al·lergògens, s'han emprat dues estratègies clarament diferenciades. D'una banda, la utilització de aptàmers com sondes de captura en la detecció del Ovomucoide (OVO) i la Gliadina (GLN) sobre superfícies planes Si3N4. D'altra banda, la implementació d'anticossos monoclonals com a molècules biològiques de captura sobre xips fotònics, s'ha dut a terme en la detecció dels al·lergògens Gliadina (GLN) i caseïna (CAS), els resultats de la qual han donat lloc a una recta de calibrat. Així mateix, s'ha realitzat un assaig per a la detecció de GLN en mostra real, procedent d'un extracte carni amb gluten de blat. Quant a la detecció de patògens, s'han utilitzat dos tipus d'estratègies, igual que per als al·lergògens. En primer lloc, l'ús de aptàmers com sondes de captura han donat com a resultat la detecció de dos ceps de caràcter no patogènic del bacteri E.coli (Origami i XL1BLUE) sobre superfícies planes de Si3N4. En segon lloc, la utilització d'un anticòs policlonal com sonda de captura, s'ha immobilitzat sobre la superfície del xip fotònic per a la detecció del Circovirus Porcí tipus 2 (PCV2) en un estudi realitzat sobre la dosi dependència del virus a diferents factors de dilució. Finalment, el desenvolupament d'una plataforma de sensat per a la detecció dels anàlits (trombina, al·lergògens i patògens) i on es vagen a implementar els diferents biosensors està en procés.

[EN] In this work the detection of analytes involved in the health sector (thrombin) and food industry (allergens and pathogens) has been carried out, through the use of a photonic biosensing system. This system, developed by the LUMENSIA Sensors team, uses the technology of silicon nitride (Si3N4) photonic chips, based on resonant ring structures (RR). The strategies of chemical functionalization and immobilization of biomolecules such as aptamers (single chain DNA fragments) and antibodies, have been performed on flat surfaces of Si3N4 for the detection of analytes, as a previous step to photonic measurements. Therefore, these strategies have been implemented in the preparation of the photonic chip for measurements in a laboratory environment (set-up). Refering to the strategy applied, it consists of the chemical activation of the sensor surface. Then on the RR of the chip, whose size is of the order of microns, the capture probe (antibody or aptamer) is immobilized, being the one in charge of specifically recognizing the analyte of interest (thrombin, allergen or pathogen). In the results obtained from thrombin, a study for the detection of thrombin in different biological matrices on flat surfaces of Si3N4 has been developed, in addition to the control on the activation of a blood sample through the use of tissue factor (TF) and calcium chloride (CaCl2). These results have served as a preliminary study to the optimization of the aptamer used as a capture probe, specific for thrombin for detection on photonic chips. Regarding the detection of allergens, two clearly differentiated strategies have been used. On the one hand, the use of aptamers as capture probes in the detection of Ovomucoid (OVO) and Gliadin (GLN) on Si3N4 flat surfaces. On the other hand, the implementation of monoclonal antibodies as biological capture molecules on photonic chips has been carried out in the detection of the allergens Gliadina (GLN) and casein (CAS), whose results have resulted in a calibration line. Likewise, an assay for the detection of GLN in real sample, from a meat extract with wheat gluten, has been carried out. As for the detection of pathogens, two types of strategies have been used, as for allergens. First, the use of aptamers as capture probes has resulted in the detection of two non-pathogenic strains of the E.coli bacteria (Origami and XL1BLUE) on flat surfaces of Si3N4. Secondly, the use of a polyclonal antibody as a capture probe has been immobilized on the surface of the photonic chip for the detection of Porcine Circovirus type 2 (PCV2) in a study on the dose dependence of the virus at different dilution factors. Finally, the development of a sensing platform for the detection of analytes (thrombin, allergens and pathogens) and where the different biosensors are going to be implemented is in process.