IMPLICACIÓN DEL SISTEMA DE MELANOCORTINAS EN LA REGULACIÓN DE LA PIGMENTACIÓN Y EL CRECIMIENTO DE LOS PECES: PAPEL DE LOS ANTAGONISTAS ENDÓGENOS

Abstract

[ES] El sistema de melanocortinas es un complejo sistema hormonal implicado en la regulación de diversas funciones fisiológicas. Todas las melanocortinas derivan de un mismo precursor peptídico denominado proopiomelanocortina (POMC), en el que están integradas las diferentes hormonas estimuladoras de los melanocitos (MSHs), la hormona adrenocorticotropa (ACTH), y el péptido opioide ¿-endorfina. Las melanocortinas señalizan a través de 5 receptores (MC1R-MC5R), con diferentes grados de especificidad hormona-receptor, lo que supone un buen ejemplo de su coevolución. El sistema de melanocortinas es el único sistema hormonal que presenta antagonistas endógenos: la proteína de señalización agouti (ASIP) y la proteína relacionada con agouti (AGRP). En mamíferos, ASIP actúa como un antagonista de MC1R. La modificación de la señalización del MC1R desequilibra la síntesis de pigmentos en el folículo piloso, potenciando la síntesis de feomelanina (pigmento amarillo-naranja) en lugar de eumelanina (pigmento negro-marrón). La expresión tegumentaria de ASIP es responsable del patrón de pigmentación dorso-ventral polarizado que tienen muchas especies de mamíferos. Esta polaridad puede observarse incluso cuando la especie presenta patrones más complejos. AGRP actúa como antagonista de MC4R, uno de los receptores de sistema nervioso central implicados en el control del metabolismo energético; a través de la regulación de la saciedad. Se ha demostrado que ASIP es capaz de antagonizar la actividad del MC4R, lo que no ocurre en condiciones normales, ya que ASIP sólo se expresa de forma local en el tegumento, y nunca alcanza el MC4R cerebral. En la cepa de ratones mutantes yellow [A(vy)/a], la expresión de ASIP queda bajo el control de un promotor de expresión ubicua que permite su síntesis en todos los tejidos incluyendo el cerebro, accediendo al MC4R central. El bloqueo/disminución de la actividad constitutiva del MC4R en esta cepa de ratones, disminuye la sensación de saciedad, aumentando los niveles de ingesta que conllevan una tasa de crecimiento, mayor pero también el desarrollo de obesidad. En los peces teleósteos los antagonistas endógenos del sistema de melanocortinas están duplicados debido a una tercera duplicación genómica (R3) específica de su rama evolutiva. Los cuatro péptidos antagonistas se identificaron inicialmente como ASIP1, ASIP2, AGRP1, y AGRP2. El principio de parsimonia asocia la expresión polarizada de ASIP1 en el tegumento de estos peces con el desarrollo del patrón de pigmentación dorsoventral que se puede observar en muchas especies y la expresión hipotalámica de AGRP1 con el control de la ingesta. El objetivo de esta tesis doctoral es demostrar la implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de la pigmentación y el balance energético de peces mediante relaciones causas-efecto de sus antagonistas endógenos. Para alcanzar este objetivo, en primer lugar, caractericé los genes ASIP1 en dos especies de peces planos: el rodaballo (Scophthalmus maximus) y el lenguado senegalés (Solea senegalensis). La elección de este grupo de teleósteos se debe a la extrema polaridad pigmentaria dorsoventral que presentan los peces planos, las numerosas malformaciones pigmentarias que aparecen en cultivo, y a la carencia de secuencias génicas caracterizadas de ASIP1 de pleuronectiformes. Los experimentos demostraron que ASIP1 se expresa masivamente en la región ventral y apenas es detectable en la región dorsal. Además, los resultados sugieren que la expresión ectópica de ASIP1 podría ser la responsable del pseudoalbinismo observado en los peces planos de cultivo. En segundo lugar, desarrollamos una nueva línea transgénica de peces cebra (Danio rerio) (tgASIP1) que expresa el gen ASIP1 de pez dorado (Carassius auratus) de forma constitutiva. Esta expresión ubicua rompía la polaridad de la expresión de ASIP1 en el tegumento y, permitía que este antagonista

[CA] El sistema de melanocortines és un complex sistema hormonal implicat en la regulació de diverses funcions fisiològiques. Totes les hormones melanocortines deriven d'un mateix pèptid precursor denominat propiomelanocortina (POMC), al qual estan integrades les diferents hormones estimuladores dels melanocits (MSHs), la hormona adrenocorticotropa (ACTH), i el pèptid opioide ß-endorfina. Les melanocortines senyalitzen a través de 5 receptors (MC1R-MC5R), amb diferents graus d'especificitat hormona-receptor, la qual cosa suposa un bon exemple de coevolució. El sistema de melanocortines és l'únic sistema hormonal que presenta antagonistes endògens: la proteïna de senyalització agouti (ASIP) i la proteïna relacionada con agouti (AGRP). En mamífers, ASIP actua com antagonista de MC1R: La modificasió de la senyalització de MC1R desequilibra la síntesi de pigments en el fol·licle pilós potenciant la síntesi de feomelanina (pigment groc-taronja) en lloc de eumelanina (pigment negre-marró). L'expressió tegumentària de ASIP és la responsable del patró de pigmentació dors-ventral polaritzat que tenen moltes espècies de mamífers. Aquesta polaritat és observable fins i tot quan l'espècia presenta patrons més complexos. AGRP actua com antagonista de MC4R, un dels receptors del sistema nerviós central implicats en el control del metabolisme energètic; en concret a través de la regularització de la sacietat. S'ha demostrat que ASIP és capaç d'antagonitzar l'activitat del MC4R, la qual cosa no succeeixen condicions normals a causa de que ASIP sols s'expressa en el tegument, i mai arriba al MC4R cerebral. En la soca de ratolins mutants yellow A(yy)/a a l'expressió d'ASIP resta baix el control d'un promotor d'expressió ubiqua que permet la síntesi en tots els teixits incloent el cervell, accedint MC4R central. El bloqueig/disminució de l'activitat constitutiva del MC4R en aquesta soca de ratolins, disminueix la sensació de sacietat, augmentant els nivells d'ingesta, produint un major taxa de creixement, però també obesitat. Als peixos teleostis els antagonistes endògens del sistema de melacortines estan duplicats a causa d'una tercera duplicació genòmica (R 3) específica de la seua branca evolutiva. Els quatre pèptids antagonistes en els teleostis foren identificats inicialment com a ASIP1, ASIP2, AGRP1 y AGRP2. El principi de parsimònia associa l'expressió polaritzada de ASIP1 en el tegument d'aquests peixos amb el desenvolupament del patró de pigmentació dors-ventral que es pot observar en moltes espècies; i l'expressió d'AGRP1 al hipotàlem amb el control de la ingesta. L'objectiu d'aquesta tesis doctoral és demostrar l'implicació del sistema de melanocortines en la regulació de la pigmentació i el balanç energètic de peixos mitjançant relacions causa-efecte dels seus antagonistes endògens. Per assolir aquest objectiu, en primer lloc, caracteritzaré ASIP1 en dues espècies de peixos plans: rèmol (Scophthalmus maximus) i el llenguado (Solea senegalensis). L'elecció d'aquest grup de teleostis es deu a l'extrema polaritat de pigmentació dors-ventral presenten els peixos plans, les nombroses malformacions pigmentàries que apareixen en en cultiu, i a la manca de seqüències gèniques caracteritzades d'ASIP1 de Pleuronectiforme. Els experiments demostraren que ASIP1 s'expressa massivament en la regió ventral i a penes és detectable en la regió dorsal. A més a més, els resultats demostren que l'expressió ectòpica d'ASIP1 podria ser la responsable del pseudealbinisme observat en els peixos en cultiu. En segon lloc, vaig desenvolupar una nova línia estratègica de peixos zebra (Danio rerio) (tgASIP1) que expressa el gen ASIP1 de carpa daurada (Carassius auratus) de forma constitutiva. Aquesta expressió ubícua trencava la polaritat de l'expressió d'ASIP1 en el tegument i, permetia que aquest antagonista accedira al MC4R cerebral. L'antagonisme competitiu d'ASIP sobre MC1R i M

[EN] Melanocortin system is a complex hormonal system involved in the regulation of several physiological functions. All melanocortin peptides are encoded by the same precursor called proopiomelanocortin (POMC) that integrates the different melanocyte-stimulating hormones (MSHs), the adrenocorticotropic hormones (ACTH) and the opioid peptide b-endorphin. Melanocortin signals through five different receptors (MC1R-MC5R) with different specificity showing a good example of co-evolutiorary processes. The melanocortin system is unique because the presence of endogenous antagonist the so-called: agouti-signalling protein (ASIP) and agouti-related protein(AGRP). In mammal species, ASIP works as an antagonist of MC1R thus unbalancing the pigment synthesis in the hair follicle from eumelanin (brown-black pigment) to pheomelanin (a yellow-red pigment). ASIP is responsible of the polarized dorsoventral pigment pattern present in most mammalian species. This polarity can be observed even when some other colour patterns are present. On the other hand, AGRP works as an antagonist of MC4R, a central receptor involved in the regulation of energy balance, throughout the regulation of satiety ASIP1 is also able to antagonize MC4R. This interaction does not occurs in the regular situation since ASIP is exclusively expressed in the tegument as a local protein and never reach the central MC4R. In the yellow mutant mouse strain [A(vy)/a], ASIP expression remains under the control of the Rely promotor that allow ubicuosly ASIP expression, including the brain, thus acting on MC4R. Disruption of MC4R signalling decrease satiety sensing thus promoting food intake, obesity and increased linear growth. In teleost fish endogenous antagonist are duplicated thanks to a specific extra genome duplication (R3). The four antagonist are initially identified as AGRP1, AGRP2, ASIP1 and ASIP2. Parsimony principle associated the skin expression of ASIP1 with the ventral pigmentary polarity of many species and the hypothalamic expression of AGRP with the control of food intake. The main goal of this doctoral thesis in to demonstrate the involvement of the melanocortin system in the regulation of pigment patterns and energy balance in fish by means of cause-effect relationships of this endogenous antagonist. To reach this objective, firstly I characterized ASIP1 in two different flatfish species, i.e. turbot (Scophthalmus maximus) and sole (Solea senegalensis). The selection of this teleost group is due to the extreme pigment dorsoventral polarity, the numerous pigment malformations in culture and the absence of characterized ASIP sequences in pleuronectiforms. The experiments demonstrate that ASIP1 is massively expressed in the ventral region and basically undetectable in the dorsal skin. Results also suggest that ectopic ASIP1 expression could be responsible of the flatfish pseudoalbinism. Subsequently, we developed a new transgenic zebrafish (Danio rerio) strain constitutively and ubicuosly overexpressing goldfish (Carassius auratus) ASIP1. The ubicuosly expression would break the dorsoventral polarity of ASIP expression in the tegumentum but also would allow reaching central MC4R. It would me allow to study at the same time the competitive antagonism on MC1R and MC4R and by extension the involvement of the melanocortin system in the regulation of pigmentation and energy balance. The experiments revealed that ASIP1 overexpression induces a ventralization of the dorsal skin by inhibiting the melanophore differentiation thus showing the existence of two differnnt pigment patterns. An ancestral dorsoventral pigment pattern on that the new stripped pattern is overimposed. Both pigment patterns are regulated in a different way since we can modify the dorsoventral pigment pattern without affecting the stripped pattern. In addition, the ubicuosly ASIP expression demonstrate the involvement of melanocortin system in the regulation of food intake and growth in fish. Food intake