Mejora genética para la resistencia a los geminivirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) y tomato yellow leaf curl sardinia virus (TYLCSV) en tomate

Abstract

[EN] Tomato yellow leaf curl disease (TYLCD) causes great damage in tomato (Solanum lycopersicum L.) crops in south-eastern Spain and in many tropical and subtropical areas in the world. The disease is caused by a complex of viruses, all belonging to the genus Begomovirus, family Geminiviridae. Nine species have been reported causing TYLCD and six more have been proposed as tentative species. Four viral species associated with TYLCD are present in Spain. Preventive measures to fight the disease, as well as measures based on controlling the insect vector (Bemisia tabaci Gen.) are not effective, so the development of resistant varieties seems the best long term strategy. Given that resistance has not been reported in the cultivated species, screening for resistance has been focused on wild tomato relatives. Resistance has been found in different wild species and some resistant breeding lines and commercial varieties have been developed. Ty-1, derived from S. chilense LA1969, is the most frequently used gene. Advances in genetic engineering techniques have also been exploited in developing plant material with pathogen derived resistance. However, resistant varieties currently available are not a solution, as with high inoculum pressure conditions and early infections, plants still develop symptoms and yield losses are caused. For that reason, many research groups continue working worldwide to obtain plants with high levels of resistance to TYLCD. Current breeding objectives are the development of broad spectrum resistance to several begomovirus, the accumulation of resistance genes from different sources to increase the levels of resistance and the identification of molecular markers tightly linked to resistance genes, which allows shortening breeding programmes and accumulating different resistance genes in the same plant material. This work has been developed in the research group ‘Breeding for resistance to Tomato yellow leaf curl disease’ of the Institute for Conservation and Improvement of Agrodiversity (COMAV). When this project was initiated, several resistant plant materials had been developed from previous works of the group. Twelve breeding lines derived from S. chilense LA1932 and LA1938 were available. These lines were resistant to Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV), the first viral species described in Spain causing TYLCD. It was of interest the evaluation of resistance in these lines to Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), introduced later in Spain and spread worldwide. Six breeding lines showed high levels of partial resistance to TYLCSV and TYLCV. The resistance consisted on attenuation and delay in symptom development, as well as reduction in viral accumulation. Significant yield losses due to viral infection were not observed in these lines. These lines also show good horticultural traits which make them appropriate to be base material for developing commercial hybrids resistant to both, TYLCSV and TYLCV. High levels of resistance have also been identified in S. pimpinellifolium UPV16991. The resistance has already been fixed in the genetic background of S. lycopersicum. It was convenient to determine the genetic control of the resistance and the expression in tomato background, before using it in breeding programmes. For these purposes L102 was selected. L102 belongs to the F6 generation, after the initial cross S. lycopersicum NE-1 x S. pimpinellifolium UPV16991. Resistance to TYLCV in L102 is controlled by one gene, with partial recessiveness and incomplete penetrance. Moreover, the expression of resistance strongly depends on S. lycopersicum background in which it is introgressed. The highest levels of resistance are obtained when crossing L102 with vigorous lines. So, we recommend to use UPV16991-derived resistance in the development of vigorous hybrids in homozygosis or combined with resistance from other sources. To exploit resistance derived from UPV16991, L102 and some other lines with the same origin were crossed with a breeding line homozygous for Ty-1. Resistance was then evaluated in several plant material heterozygous for both, Ty-1 and the resistance gene from UPV16991. These plant materials showed higher levels of resistance than heterozygotes for each of the genes. Resistance in one of the hybrids was even higher than in homozygotes for each of the genes. These results show that combining resistance from UPV16991 with Ty-1 is the most practical approach to exploiting this resistance, since it allows the development of hybrids without the need of fixing the resistance gene in both parents. Finally, availability of molecular markers tightly linked to the resistance genes is essential to accumulate resistance from different sources. Some molecular markers tightly linked to Ty-1 have been reported. However, in all cases, S. peruvianum-derived Mi gene interferes with these markers, causing false positive results. In this work, a molecular marker, JB-1, tightly linked to Ty-1 has been identified. This is a CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic DNA) marker. The presence of Mi, as well as introgressions from other wild tomato relatives such as S. lycopersicum (formerly Lycopersicon esculentum var. cerasiforme), S. habrochaites and S. pimpinellifolium do not interfere with the results for this marker. In addition, the analysis of several plant material with introgressions from different wild tomato relatives has allowed the location of CT21, the RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) marker from which JB-1 was designed.

[ES] La enfermedad del rizado amarillo del tomate (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD) causa graves daños en los cultivos de tomate (Solanum lycopersicum L.) del sudeste español y de la mayor parte de las zonas tropicales y subtropicales de todo el mundo. La enfermedad está causada por un complejo de virus pertenecientes al género Begomovirus, familia Geminiviridae. Se han descrito nueve especies causantes de TYLCD y otras seis han sido propuestas. En España están presentes cuatro de las especies virales asociadas a TYLCD. Las medidas preventivas de lucha contra la enfermedad, así como las basadas en el control del insecto vector transmisor (Bemisia tabaci Gen.) no resultan efectivas por si mismas, de forma que el desarrollo de materiales resistentes supone la mejor estrategia de lucha a largo plazo. Dado que en la especie cultivada no se han descrito entradas resistentes, la búsqueda de fuentes de resistencia se ha centrado en las especies silvestres del género relacionadas con el tomate. Se ha encontrado resistencia en distintas entradas de algunas de estas especies y se han desarrollado líneas de mejora y materiales comerciales con resistencia procedente de algunas de ellas. El gen Ty-1, derivado de la entrada LA1969 de S. chilense, ha sido el más empleado para la obtención de líneas e híbridos comerciales resistentes. Por otra parte, haciendo uso de los avances en las técnicas de ingeniería genética, también se han desarrollado materiales con resistencia derivada del patógeno. Sin embargo, los materiales resistentes disponibles hasta el momento no suponen una solución definitiva al problema, ya que, con presiones fuertes de inóculo o infecciones tempranas, las plantas desarrollan síntomas de la enfermedad, produciéndose pérdidas de producción. Por este motivo, numerosos grupos de investigación continúan trabajando a nivel mundial con la finalidad de obtener materiales con niveles elevados de resistencia a TYLCD. Entre los objetivos actuales de mejora se incluyen el desarrollo de resistencia de amplio espectro a varios begomovirus, la combinación de genes de distinta procedencia para conseguir mayores niveles de resistencia y la identificación de marcadores moleculares ligados a los genes de resistencia que permitan acortar los programas de mejora y acumular en un mismo material genes de resistencia de distintas fuentes. El grupo de “Mejora para la resistencia a la enfermedad del rizado amarillo del tomate”, del Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV), en el que se ha realizado la presente tesis doctoral, disponía al inicio de la misma de distintos materiales con resistencia a TYLCD, desarrollados en trabajos previos. Entre estos materiales se encontraban 12 líneas de mejora derivadas de la entradas LA1932 y LA1938 de S. chilense, seleccionadas por su resistencia a la especie Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV), la primera especie viral causante de TYLCD detectada en España. Resultaba de interés evaluar la respuesta de estos materiales a la especie Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), introducida posteriormente en España y más extendida a nivel mundial. Seis de las líneas evaluadas han mostrado niveles elevados de resistencia parcial a TYLCSV y TYLCV, consistente en la atenuación en la manifestación de síntomas y retraso en el momento de aparición de los mismos, además de en la reducción de la acumulación viral. Además, no se han observado en estas líneas pérdidas significativas en el rendimiento como consecuencia de la infección por TYLCV. Las características agronómicas las hacen apropiadas como parentales para el desarrollo de híbridos con elevada resistencia a TYLCSV y TYLCV. Por otra parte, se habían identificado niveles elevados de resistencia en la entrada UPV16991 de S. pimpinellifolium. Una vez fijada la resistencia en el fondo genético de S. lycopersicum, y como paso previo al empleo en programas de mejora, era conveniente determinar el control genético de la misma, así como conocer su expresión en el fondo genético de la especie cultivada. Para ello se ha empleado la línea L102, que corresponde a la quinta generación de autofecundación a partir del cruce inicial S. lycopersicum NE-1 x S. pimpinellifolium UPV16991. Se ha comprobado que la resistencia parcial a TYLCV de la línea L102 está controlada por un gen con recesividad parcial y penetración incompleta. Además, la expresión de la misma depende considerablemente del fondo genético de S. lycopersicum en el que se introgresa, obteniéndose los mayores niveles de resistencia en cruces con líneas vigorosas. Por todo esto, se recomienda el uso de esta resistencia bien en homocigosis en el desarrollo de híbridos vigorosos, bien en combinación con resistencia procedente de otras fuentes. En este sentido, se decidió evaluar la resistencia en materiales que combinaban el gen Ty-1 y el gen derivado de UPV16991, ambos en heterocigosis. El nivel de resistencia en estos materiales ha sido superior al mostrado por los heterocigotos para cada uno de los genes, e incluso en algún caso se ha superado la resistencia de los homocigotos para cada uno de los genes. Esto indica que la combinación de la resistencia derivada de UPV16991 con el gen Ty-1 es la aproximación más práctica para la utilización de esta resistencia, ya que evita la necesidad de fijar el gen de resistencia en ambos parentales. Por último, para la acumulación de resistencia de distinta procedencia en un mismo material, resulta imprescindible disponer de marcadores moleculares ligados a los genes de resistencia. Se han descrito algunos marcadores ligados al gen Ty-1, sin embargo, la presencia del gen Mi, derivado de S. peruvianum, interfiere con los resultados para estos marcadores, obteniéndose falsos positivos. En este trabajo se ha identificado un marcador molecular, JB-1, tipo CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic DNA) ligado al gen de resistencia Ty-1. La presencia del gen Mi, así como introgresiones de otras especies como S. lycopersicum (antes Lycopersicon esculentum var. cerasiforme), S. habrochaites y S. pimpinellifolium, no interfieren con los resultados para este marcador. Además, el análisis de materiales con introgresiones de distintas especies silvestres relacionadas con el tomate para varios marcadores de la región del Ty-1 ha permitido localizar el marcador CT21, el RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) a partir del cual se desarrolló JB-1.

[CA] La malaltia de l’arrissat groc de la tomaca (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD) causa greus danys als cultius de tomaca (Solanum lycopersicum L.) del sud-est espanyol i de la major part de les zones tropicals i subtropicals de tot el món. La malaltia està causada per un complex de virus pertanyents al gènere Begomovirus, família Geminiviridae. S’han descrit nou espècies causants de TYLCD i altres sis han sigut proposades. A Espanya estan presents quatre de les espècies virals associades a TYLCD. Les mesures preventives de lluita contra la malaltia, així com les basades en el control de l’insecte vector transmissor (Bemisia tabaci Gen.) no resulten efectives per si mateixes, de manera que el desenvolupament de materials resistents suposa la millor estratègia de lluita a llarg termini. Atés que en l’espècie cultivada no s’han descrit entrades resistents, la recerca de fonts de resistència s’ha centrat en les espècies silvestres del gènere relacionades amb la tomaca. S’ha trobat resistència en distintes entrades d’algunes d’estes espècies i s’han desenvolupat línies de millora i materials comercials amb resistència procedent d’algunes d’elles. El gen Ty-1, derivat de l’entrada LA1969 de S. chilense, ha sigut el més utilitzat per a l’obtenció de línies i híbrids comercials resistents. D’altra banda, fent ús dels avanços en les tècniques d’enginyeria genètica, també s’han desenvolupat materials amb resistència derivada del patogen. No obstant, els materials resistents disponibles fins al moment no suposen una solució definitiva al problema, ja que, amb pressions fortes d’inòcul o infeccions primerenques, les plantes desenvolupen símptomes de la malaltia, produint-se pèrdues de producció. Per este motiu, nombrosos grups d’investigació continuen treballant a nivell mundial amb la finalitat d’obtindre materials amb nivells elevats de resistència a TYLCD. Entre els objectius actuals de millora s’inclouen el desenvolupament de resistència d’ampli espectre a diversos begomovirus, la combinació de gens de distinta procedència per a aconseguir majors nivells de resistència i la identificació de marcadors moleculars lligats als gens de resistència que permeten acurtar els programes de millora i acumular en un mateix material gens de resistència de distintes fonts. El grup de “Millora per a la resistència a la malaltia de l’arrissat groc de la tomaca”, de l’Institut de Conservació i Millora de l’Agrodiversitat Valenciana (COMAV), en el que s’ha realitzat la present tesi doctoral, disposava a l’inici de la mateixa, de distints materials amb resistència a TYLCD, desenvolupats en treballs previs. Entre estos materials es trobaven 12 línies de millora derivades de l’entrades LA1932 i LA1938 de S. chilense, seleccionades per la seua resistència a l’espècie Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV), la primera espècie viral causant de TYLCD detectada a Espanya. Resultava d’interés avaluar la resposta d’estos materials a l’espècie Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), introduïda posteriorment a Espanya i més estesa a nivell mundial. Sis de les línies avaluades han mostrat nivells elevats de resistència parcial a TYLCSV i TYLCV, consistent en l’atenuació en la manifestació de símptomes, retard en el moment d’aparició dels mateixos i reducció de l’acumulació viral. A més, no s’han observat en estes línies pèrdues significatives en el rendiment com a conseqüència de la infecció per TYLCV. Les característiques agronòmiques les fan apropiades com a parentals pel desenvolupament d’híbrids amb elevada resistència a TYLCSV i TYLCV. D’altra banda, s’havien identificat nivells elevats de resistència en l’entrada UPV16991 de S. pimpinellifolium. Una vegada fixada la resistència en el fons genètic de S. lycopersicum, i com a pas previ a l’ús en programes de millora, era convenient determinar el control genètic de la mateixa, així com conéixer la seua expressió en el fons genètic de l’espècie cultivada. Per a això s’ha emprat la línia L102, que correspon a la quinta generació d’autofecundació a partir del creuament inicial S. lycopersicum NE-1 x S. pimpinellifolium UPV16991. S’ha comprovat que la resistència parcial a TYLCV de la línia L102 està controlada per un gen amb recessivitat parcial i penetració incompleta. A més, l’expressió de la mateixa depén considerablement del fons genètic de S. lycopersicum en el que s’introgresa, obtenint-se els majors nivells de resistència en creuaments amb línies vigoroses. Per tot açò, es recomana l’ús d’esta resistència bé en homozigosis en el desenvolupament d’híbrids vigorosos, bé en combinació amb resistència procedent d’altres fonts. En este sentit, es va decidir avaluar la resistència en materials que combinaven el gen Ty-1 i el gen derivat d’UPV16991, ambdós en heterozigosis. El nivell de resistència en estos materials ha sigut superior al mostrat pels heterozigots per a cada un dels gens, i fins i tot en algun cas s’ha superat la resistència dels homozigots per a cada un dels gens. Açò indica que la combinació de la resistència derivada d’UPV16991 amb el gen Ty-1 és l’aproximació més pràctica per a la utilització d’esta resistència, ja que evita la necessitat de fixar el gen de resistència en ambdós parentals. Finalment, per a l’acumulació de resistència de distinta procedència en un mateix material, resulta imprescindible disposar de marcadors moleculars lligats als gens de resistència. S’han descrit alguns marcadors lligats al gen Ty-1, no obstant, la presència del gen Mi, derivat de S. peruvianum, interferix amb els resultats per a estos marcadors, obtenint-se falsos positius. En este treball s’ha identificat un marcador molecular, JB-1, tipus CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic DNA) lligat al gen de resistència Ty-1. La presència del gen Mi, així com introgresions d’altres espècies com S. lycopersicum (abans Lycopersicon esculentum var. cerasiforme), S. habrochaites i S. pimpinellifolium, no interferixen amb els resultats per a este marcador. A més, l’anàlisi de materials amb introgresions de distintes espècies silvestres relacionades amb la tomaca per a diversos marcadors de la regió del Ty-1 ha permés localitzar el marcador CT21, el RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) a partir del qual es va desenvolupar JB-1.