Identificación de los receptores de las translocasas de proteínas de mitocondrias y cloroplastos implicadas en el transporte dual de la proteína de cubierta del virus de las manchas necróticas del melón

Abstract

[ES] El transporte específico de proteínas a mitocondrias o cloroplastos se realiza por medio de dos complejos de canales proteicos o translocasas ubicados en las membranas externa (TOM/TOC) e interna (TIM/TIC). Aunque no existe similitud entre las translocasas mitocondriales y cloroplásticas, se han caracterizado más de cien proteínas que son transportadas a ambos compartimentos subcelulares (transporte dual). Suelen ser proteínas implicadas en procesos funcionales conservados y compartidos por ambos orgánulos: replicación, recombinación y reparación del DNA; transcripción, traducción y proteólisis. Salvo alguna excepción, estas proteínas presentan un péptido señal en su extremo N-terminal, denominado péptido de tránsito dual (dual transit peptide, dTP), con propiedades fisicoquímicas intermedias entre las de los péptidos señal de transporte a mitocondrias (mTP) o cloroplastos (cTP). El mecanismo que subyace en el reconocimiento de los determinantes del dTP aún no se conoce, por lo que se pueden considerar varias posibilidades: la presencia de un receptor común a ambos sistemas que reconozca específicamente los dTP, la presencia de dTP multipartitos que alberguen la información del destino en diferentes dominios y que serían reconocidos por diferentes receptores y, por último, cabe la posibilidad de que diferentes receptores puedan reconocer un dTP ambiguo donde la información se distribuyera a lo largo de su secuencia. A modo de ejemplo comentar que, recientemente, se ha mostrado que el dTP de la Thr-tRNA sintetasa interactúa con AtTom20 y AtToc34, los principales receptores de las translocasas TOM y TOC en Arabidopsis thaliana, respectivamente. En estudios previos realizados en el grupo de investigación donde se va a realizar este Trabajo Final de Master, se observó que la proteína de cubierta (coat protein, CP) del virus de las manchas necróticas del melón (Melon necrotic spot virus, MNSV) presentaba una localización subcelular dual en mitocondrias y cloroplastos. Además, en experimentos realizados con mutantes de deleción se determinó que los primeros 90 aminoácidos de la CP de MNSV pueden ser considerados como un dTP ambiguo. Por tanto, consideramos que esta proteína puede ser utilizada como una herramienta de trabajo para profundizar en el estudio del mecanismo molecular implicado en el reconocimiento y el transporte dual de proteínas a estos orgánulos. En concreto, en este trabajo se pretende identificar los receptores del huésped implicados en el transporte dual de la CP de MNSV a mitocondrias y cloroplastos. Para ello se realizarán ensayos de complementación bimolecular de la fluorescencia (BiFC) de la proteína viral con los principales receptores de los sistemas TOC y TOM caracterizados actualmente y que se detallan a continuación. El reconocimiento de proteínas precursoras en la membrana externa cloroplástica está mediado por las GTPasas Toc159 y Toc34. La familia de receptores Toc 159 en Arabidopsis thaliana está formada por cuatro proteínas: AtToc159, AtToc132, AtToc120 y AtToc90. En cambio, Toc34, está codificado en dos genes homólogos, AtTOC33 y AtTOC34. Mientras que AtTOC34 muestra una expresión relativamente uniforme a lo largo del desarrollo y participa en el transporte de factores no fotosintéticos, AtTOC33 está fuertemente inducida en tejidos fotosintéticos de rápido crecimiento y está involucrado preferentemente en transporte de proteínas fotosintéticas. Los complejos TOC y TIC están interconectados por componentes del espacio intermembrana como Tic22, de los cuales existen dos isoformas estrechamente relacionadas en A. thaliana, AtTic22-III y AtTi22-IV. Finalmente, los principales receptores en las mitocondrias son OM64 y Tom20, que tiene cuatro isoformas diferentes en A. thaliana, AtTom20-1, AtTom20-2, AtTom20-3 y AtTom20-4. En este escenario, el TFM se iniciará utilizando los factores de A. thaliana descritos anteriormente, pero considera