Estudio de diversos parámetros que afectan la edición genómica mediada por CRISPR-Cas12a/Cas9 en Nicotiana benthamiana

Abstract

[ES] En los últimos años, la tecnología CRISPR ha revolucionado la ingeniería del genoma en las plantas. El sistema CRISPR / Cas ofrece una alternativa para la generación de rupturas de doble cadena de ADN (DSB) en un lugar específico, allanando el camino para mejorar los rasgos del organismo. La desactivación de genes se basa en los errores del mecanismo de reparación de ADN de unión final no homóloga (NHEJ) tras la producción de DSB hechos a propósito en los genes de interés, lo que da como resultado la interrupción de sus secuencias codificantes. En esta tesis de Master, hemos analizado la generación de estos DSB mediada por CRISPR-Cas12a / Cas9, así como explorar diferentes parámetros que podrían mejorar el rendimiento de Cas12a y Cas9 en N. benthamiana. Entre ellos, se evaluó la influencia de la temperatura en las eficiencia de edición, la capacidad de "multiplexing" de diferentes ortólogos de Cas o la implementación del sistema CRISPR / ErCas12a recientemente descrito. Además, estudiamos la fiabilidad de los algoritmos disponibles para predecir el rendimiento del ARN guía en N. benthamiana observando que los algoritmos disponibles para Cas12a son más precisos que los disponibles para Cas9. En contraste, la reparación de DSB mediada por HR permite su modificación dirigida al introducir una molécula de ADN donante con los cambios previstos para su reparación. Estas son la base de la modificación dirigida de genes y las estrategias de "knock-in". Sin embargo, su eficiencia reducida cuando se aplica en plantas ha limitado su utilidad. Por esta razón, esta tesis de Master también se ha centrado en un sistema para mejorar su rendimiento en N. benthamiana, evaluando el uso de replicones basados ​​en ADN, como geminivirus, para la introducción de la secuencia de ADN utilizada en estas estrategias de edición mediadas por recombinación homóloga.

[EN] Over the past years, CRISPR technology has revolutionized genome engineering in plants. The CRISPR/Cas system provides an alternative for the generation of DNA Double Strand Breaks (DSBs) at a specific target locus, paving the way for improving organism traits. Gene knockout relies on the errors of the non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism upon the production of DSBs deliberately on the genes of interest, resulting in the disruption of their coding sequences. In this Master s thesis, we have analyzed CRISPR-Cas12a/Cas9-mediated generation of these DSBs, as well as explored different parameters that could improve Cas12a and Cas9 performance in N. benthamiana. Among them, temperature influence on the editing efficiencies, multiplexing capacity of different Cas orthologues, or the implementation of the recently described CRISPR/ErCas12a system were tested. Additionally, we studied the reliability of the available algorithms to predict guide RNAs performance in N. benthamiana observing that algorithms available for Cas12a are more accurate than those available for Cas9. In contrast, HR-mediated repair of DSBs allows their deliberate modification by introducing a donor DNA molecule with the intended changes for its repairing. These are the basis of gene targeting and gene knock-in strategies. Nevertheless, their reduced efficiency when applied in plants have limited their utility. For this reason, this Master s thesis has also focused on a system to improve their performance in N. benthamiana, evaluating the use of DNA-based replicons, such as geminiviruses, for the delivery of the DNA sequence used on these HR-mediated editing strategies.