Identificación de mutaciones tipo green flesh , caracterización y análisis del efecto en la maduración y post-cosecha del tomate

Abstract

[ES] Los frutos del tomate cultivado exhiben una diversidad fenotípica de tamaño, forma y color resultado de la selección durante la domesticación y los subsecuentes esfuerzos de mejora. Sin embargo, la mejora del tomate cultivado moderno ha estado enfocada principalmente a conseguir un alto rendimiento de cultivo y resistencias, lo cual ha provocado una pérdida en el sabor de los cultivares modernos y una disminución de la variabilidad genética. Frente a esta disminución, las variedades tradicionales del tomate son un potente recurso para agricultores e investigadores al ser una gran fuente de germoplasma. El proyecto TRADITOM tiene como objetivo identificar, preservar y valorizar la diversidad genética que almacenan las variedades tradicionales de tomate Europeo y sus prácticas de cultivo.

La maduración del fruto de tomate se caracteriza por el cambio de color progresivo de verde a rojo asociada a la transición de los cloroplastos a cromoplastos. Durante esta transición tiene lugar la degradación de la clorofila contenida en las membranas tilacoidales, la desestructuración del grana, la reducción de la expresión de genes relacionados con la fotosíntesis y la acumulación de carotenoides, principalmente licopeno, en estructuras cristalinas dentro de los cromoplastos (Egea et al. 2010).

Los mutantes green flesh (gf) de tomate presentan un fenotipo Stay-green (verde permanente) y en el estadio maduro retienen clorofila simultáneamente a la acumulación de licopeno presentando un color rojo-marrón (Cheung et al. 1993; Barry et al. 2008). El locus gf (Solyc08g080090) codifica para la proteína SGR1, una magnesio dequelatasa cloroplastídica implicada en el catabolismo de la clorofila. Existen muchas variedades tradicionales de tomate cuyo fenotipo es similar al de los mutantes gf incluso variedades en las que se han identificado alelos gf (Barry & Pandey 2009). green flesh junto con otras mutaciones relacionadas con la biogénesis de los cloroplastos o la fotosíntesis está relacionada con un impacto positivo en la composición y valor nutricional del fruto (Cocaliadis et al. 2014).

Enmarcado en el proyecto TRADITOM, el objetivo de este trabajo será llevar a cabo un análisis genético y fenotípico de las mutaciones tipo gf de tomate. Para ello se llevará a cabo:

El análisis genético de las variedades tradicionales que no degradan clorofila: 1) caracterización de la región alrededor de gf, 2) búsqueda de mutaciones en otras regiones según estrategias dirigidas (ruta de clorofilas) o no dirigidas (análisis de pools) Caracterización fenotípica de las variedades tradicionales tipo gf y de mutantes gf obtenidos mediante CRISPR Cas9 o Caracterización del proceso de maduración: color, clorofila, firmeza y metabolitos o Estudios post-cosecha SSL y ESL. Susceptibilidad a la infección por patógenos, y parámetros de calidad post-cosecha. o Caracterización de la estructura y subestructura del fruto. Análisis con Tomato Analyzer (http://www.plant-image-analysis.org/software/tomato-analyser) y microscopia. o Análisis por RT-PCR de genes candidato procedentes del análisis genético

Barry, C.S. et al., 2008. Amino acid substitutions in homologs of the STAY-GREEN protein are responsible for the green-flesh and chlorophyll retainer mutations of tomato and pepper. Plant Physiology, 147(1), pp.179 187. Barry, C.S. & Pandey, P., 2009. A survey of cultivated heirloom tomato varieties identifies four new mutant alleles at the green-flesh locus. Molecular Breeding, 24(3), pp.269 276. Cheung, a. Y., McNellis, T. & Piekos, B., 1993. Maintenance of Chloroplast Components during Chromoplast Differentiation in the Tomato Mutant Green Flesh. Plant physiology, 101, pp.1223 1229. Cocaliadis, M.F. et al., 2014. Increasing tomato fruit quality by enhancing fruit chloroplast function. A double-edged sword? Journal of Experimental Botany, 65(16), pp.4589 4598. Egea, I. et al., 2010.

[EN] Tomato breeding is today focus on yield and sustainability improvement, together with nutritional content and consumer preferences. Landrace tomato varieties, which exhibit great phenotypic diversity, are a genetic reservoir of allelic variants related with traits of interest, with potential use in breeding programs. Chlorophyll retention during tomato ripening has been shown as strategy to increase tomato fruit nutritional content. green flesh (gf) tomato mutation is characterized by chlorophyll retention during ripening and has been associated with an increase in postharvest self-life. In this work postharvest ripening and Green Flesh locus has been characterized within a collection of 27 heirloom tomato varieties, which present different chlorophyll degradation phenotypes. It has included the tomato cultivar ‘Moneymaker’, characterized for fast postharvest chlorophyll degradation, and two crispr Green Flesh gene (GF) loss of function (KO) lines with ‘Moneymaker’ genetic background. The results have shown phenotypic and allelic diversity in postharvest traits (chlorophyll degradation, firmness and colour) present in heirloom varieties. It has been described different chlorophyll degradation phenotypes and it has been identified different GF KO alleles, one 1163 bp deletion described by previously work and another one new SNP. GF expression analysis seems to indicate that chlorophyll degradation trait is influenced by other loci besides GF. By GWAS three candidate genes for the postharvest chlorophyll degradation trait have been identified in two collections of ~200 and ~500 traditional tomato varieties genotyped by GBS. Furthermore, despite, crispr GF KO lines showed an increase in cuticle thickness compared to ‘Moneymaker’, did not exhibited an improvement in the postharvest self-life, as previously had been reported.

[CA] La millora actual dels cultius te com objectiu augmentar el rendiment i la sostenibilitat, junt amb el contingut nutricional, tenint en compte les preferències del consumidor. Les varietats tradicionals de tomata, que exhibeixen una gran diversitat fenotípica, són un reservori genètic de variants al·lèliques relacionades amb caràcters d’interès, amb potencial per al seu us en programes de millora. La mutació de tomata green flesh (gf) es caracteritza per retenir la clorofil·la al llarg de la maduració del fruit i s’ha associat a un increment de la vida mitja postcollita. En aquest treball, s’ha caracteritzat la maduració post collita i el locus Green Flesh (GF) en una col·lecció de 27 varietats de tradicionals de tomata amb diferents fenotips de degradació de clorofil·la. S’ha inclòs el cultivar ‘Moneymaker’, amb degradació post-collita de la clorofil·la ràpida, i dues crispr línies de perduda de funció (KO) de GF en fons genètic ‘Moneymaker’. Els resultats han mostrat la diversitat fenotípica i al·lèlica present en caràcters postcollita (degradació de clorofil·la, fermesa i color) en les varietats tradicionals de tomata. S’han descrit diferents fenotips en la degradació de la clorofil·la i s’han identificat diferents al·lels KO al gen GF, una deleció de 1163 pb prèviament descrita en altres treballs i un altre SNP nou. L’anàlisi d’expressió de GF sembla indicar que el caràcter de degradació de clorofil·la està influenciat per altres loci a banda de GF. Mitjançant GWAS s’ha identificat tres gens candidats per al caràcter de degradació post-collita de clorofil·la en dues col·leccions de ~200 varietats tradicionals de tomata genotipades per GBS. A més, les línies crisper KO per al gen GF, malgrat mostrar un major gruix de la cutícula respecte a ‘Moneymaker’, no han exhibit una millora en la vida mitja post-collita com es descrivia en un treball previ.