DESARROLLO DE UN VECTOR PARA LA EXPRESIÓN SIMULTÁNEA DE MÚLTIPLES PROTEÍNAS EN PLANTAS BASADO EN EL POTYVIRUS DEL GRABADO DEL TABACO

Abstract

Las plantas son útiles para la producción de proteínas heterólogas y otros productos de aplicación en medicina o industria, así como los virus de vegetales. El virus del grabado del tabaco (TEV), es un virus de RNA de cadena positiva ampliamente empleado en estudios sobre biología molecular de virus de plantas. Con base en un clon infeccioso de este virus, se ha desarrollado un vector viral desarmado que permite la expresión simultánea de múltiples proteínas heterólogas en plantas. Como primera etapa se construyeron 3 nuevos plásmidos con el mismo clon infeccioso del TEV que permitieran infectar plantas con RNA transcrito in vitro (pMTEV), con DNA (p35TEV) o por agroinoculación (pGTEV). El vector de expresión se construyó sobre el plásmido pGTEV, reemplazando el cistrón que codifica la proteína NIb por un casete que contenía los cDNAs de las proteínas heterólogas flanqueados por sitios de corte naturales y artificiales de la proteasa viral NIaPro. Se construyeron dos versiones del vector, uno que expresa tres proteínas fluorescentes, roja, amarilla y azul, y otro que expresa dos factores de transcripción de A. majus (Delila y Rosea1) de la ruta de biosíntesis de las antocianinas. Al inocular plantas de tabaco transgénicas, que suplementan la función NIb, se detectó la expresión colocalizada de las 3 proteínas fluorescentes tanto a nivel de tejido como subcelular, se comprobó el eficiente procesamiento de cada proteína heteróloga y se probó que el vector es incapaz de infectar plantas en las que la función NIb no se suplementa. En la expresión de Delila y Rosea1, la inoculación de plantas provocó una alta acumulación de antocianinas en los tejidos infectados por el virus adquiriendo una coloración rojiza. A continuación, se analizó el efecto de insertar un segundo supresor viral del silenciamiento, y los resultados sobre un vector que expresa la proteína fluorescente roja mostraron que la coexpresión de la proteína P19 del virus del enanismo arbustivo del tomate (TBSV) aumenta la expresión en aproximadamente un 50%, y la proteína 2b del virus del mosaico del pepino (CMV) la aumenta un 20%. En contraste, la proteína 16K del virus del cascabeleo del tabaco (TRV) no tiene ningún efecto, mientras que la proteína HC-Pro de otro potyvirus, el virus de la sharka de los frutales de hueso, tiene un efecto negativo.